大肠埃希菌表达的含ptd穿膜序列的融合 蛋白3种复性方法比较

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1、大肠埃希菌表达的含PTD穿膜序列的融合蛋白3种复性方法比较【摘要】目的：探索融合蛋白PTDNFATminiDBDeGFP纯化以及复性的条件，以提高其复性效率，为后续融合蛋白生物学功能的研究做准备。方法：表达、提取并纯化包涵体形式的融合蛋白PTDNFATminiDBDeGFP，分别用稀释复性、透析复性、柱上复性的方法，对融合蛋白进行复性，分析不同方法的特点及包涵体复性率，采用流式细胞术检测融合蛋白的穿膜活性。结果：3种复性方法得到的融合蛋白复性率依次为：柱上复性得率最高，其次是透析复性，稀释复性得率最低。柱上复性后蛋白的穿膜效率最高，相对较低的是稀

2、释复性，而未复性的融合蛋白穿膜效率极低。结论：3种复性方法均能对PTD穿膜蛋白复性，但以柱上复性最佳。【关键词】蛋白转导域复性包涵体［Abstract］Objective:ToinvestigatetherenaturationparametersofinclusionbodiesofthefusionproteinPTDNFATminiDBDeGFPandtoimprovetherefoldingefficiencyforthefurtherresearchofitsbiofunctioninTcells.Methods：Expressed,ex

3、tractedandpurifiedthefusionproteinPTDNFATminiDBDeGFPandrenaturateditbydilution,dialysisandrefoldingviaImmol/LobilizedMetalIonAffinity9Chromatography（IMAC),respectively.Aflowcytometryassaywasusedtodetecttheeffectofthefusionproteintotransduceintothecellscytoplasm.Results：Thefus

4、ionproteincouldberefoldedbydifferentrenaturationways.ThelowestandhighestrefoldingyieldscouldbeobtainedbydilutionandrefoldingviaIMAC,respectively.TheflowcytometryanalysisindicatedthattherenaturatedproteincouldtransduceintoJurkatcellsefficientlyandthedenaturationproteinhadlowactivi

5、ty.Conclusion：ThefusionproteinPTDNFATminiDBDeGFPwasrefoldedsuccessfullybythethreemethods.Moreover,refoldingviaIMACwasthebestoneforPTDNFATminiDBDeGFPfusionprotein.［Keywords］proteintransductiondomain;refolding;inclusionbodies(IBS)蛋白转导结构域（proteintransductiondomain，PTD）是近年来发现的由HI

6、V基因编码的具穿膜功能的反式激活蛋白(transactivatortranscription,TAT)中一段富含碱性氨基酸，带较多正电荷的多肽，它能够有效地引导与之共价相连的核酸、多肽、蛋白质等进入细胞。这种转导不依赖受体和转运蛋白，也不涉及温度和能量转换，且转导速度快，效率高［1,29］，具有广谱的蛋白转导作用。外源性重组蛋白在大肠埃希菌中的高效表达率，使得蛋白不能形成正确折叠而以不溶性包涵体形式存在。包涵体形式表达的重组蛋白只有通过复性才能得到有生物学活性的蛋白质。然而，不同的蛋白质结构和理化性质差异很大，对不同的变性剂和复性液的反应也不尽相同［3

7、-5］，因此，需要通过试验摸索出适合自身蛋白复性的方法。本文通过试验研究了不同复性方法的蛋白得率和复性后蛋白的穿膜效率，并比较了不同方法的特点，现报告如下。1材料和方法1.1材料pQE30PTDNFATminiDBDeGFP原核表达载体由我室构建，工程菌E.coliM15，Jurkat细胞为我室保存；纯化树脂ProfinityIMAC金属螯合填料购自BioRad公司；鼠抗-6×His单克隆抗体购于CellSignaling公司，HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗以及DAB显色剂购于北京中杉公司；蛋白分子量标准参照物购于Fermentas公司；还原型谷

8、胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、IPTG购自南京建成生物公司，其余