可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的原核表达、鉴定与纯化及其对皮质神经元的跨膜转导.doc

《可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的原核表达、鉴定与纯化及其对皮质神经元的跨膜转导.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、可溶性TATPTD-Ngb融合蛋白的原核表达、鉴定与纯化及其对皮质神经元的跨膜转导作者：周国钰，胡学强，胡骏，陆正齐，楼之茵，朱灿胜，熊洁萍【摘要】【目的】构建含蛋白转导域(proteintransductiondomain,PTD)与脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)融合基因的表达质粒，原核表达可溶性TATPTD-Ngb，并鉴定、纯化，检测TATPTD-Ngb对皮质神经元的跨膜转导功能。【方法】提取SD大鼠脑组织总RNA，通过RT-PCR法构建编码TATPTD-Ngb的融合基因，克隆入pE

2、T28b原核表达载体，转化入大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析及可溶性鉴定，利用所表达的目的蛋白上的6个组蛋白用Ni-NTA琼脂进行亲和层析纯化，将不同浓度纯化的融合蛋白与原代培养皮质神经元共孵育2h，用Western-blot分析融合蛋白的跨膜转导。【结果】成功构建了含有TATPTD-Ngb的原核表达载体，插入片段500bp，成功表达并纯化了可溶性TATPTD-Ngb融合蛋白，相对分子质量约为20k，Westernblot鉴定

3、显示表达蛋白具有抗原性，并具有转导入原代培养皮质神经元的功能，随给予蛋白浓度的增高进入神经元内的融合蛋白量增高。【结论】可溶性融合蛋白TATPTD-Ngb可转导入皮质神经元，对进一步研究Ngb的功能及蛋白转导技术的应用奠定了基础。【关键词】蛋白转导域；脑红蛋白；可溶性原核表达合入扩增的Ngb5′端，构建含有TATPTD-Ngb融合基因的原核表达质粒，诱导表达、鉴定及纯化，用原代培养的原代皮质神经元对其跨膜转导功能进行检测，为下一步利用蛋白转导技术研究Ngb在神经系统内的功能奠定基础，提供新的方法。1

4、材料与方法1.1材料1.1.1质粒和菌株　T7RNA聚合酶调控的表达质粒pET28b及表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌BL21（DE3）plysS购自Novagen公司；pMD19-Tsimple载体购自大连宝生物工程公司；大肠杆菌DH5α由本校药理学教研室胡骏博士赠送。1.1.2试剂　Trizol试剂购自Invitrogen公司；合成cDNA第一链的逆转录试剂盒购自Fermentas公司；TaqDNA聚合、T46DNA连接酶和各种限制性内切酶购于大连宝生物工程公司；X-gal、IPTG购于AMRES

5、CO公司；质粒抽提试剂盒、胶回收纯化试剂及Ni-NTA蛋白亲和纯化琼脂购于QIAGEN公司；抗His-Tag小鼠单克隆抗体购于TIAGEN公司，羊抗小鼠二抗购于武汉博士德生物技术有限公司；氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素均为SIGMA分装；ECL试剂购自PIERCE公司；Neurobasal培养基及B27购自Gibco公司。其余常规试剂均为进口或国产分析纯。1.1.3PCR引物　根据Genbank中大鼠Ngb和TAT-PTD基因序列设计了两条引物，即在Ngb成熟肽基因序列的5′端融合了含有PTD基因序列

6、，由上海生工生物技术有限公司合成。上游引物：5′CATATGAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAGCTAGCATGGAGCGCCTAGAGTCAGAGCT3′（含NdeⅠ、NheⅠ酶切位点）；下游引物：5′GAGCTCTACTCCCCGTCCCAGCCTCG3′（含SacⅠ酶切位点）。扩增产物片段500bp。1.1.4实验动物　SD乳鼠由中山大学实验动物中心提供。１.2　TATPTD-Ngb基因的克隆1.2.1RT-PCR扩增TATPTD-Ngb基因取SD乳鼠脑组织用Trizol试

7、剂提取脑组织总RNA，按逆转录试剂盒说明合成cDNA第一条链，取2μＬ逆转录产物进行PCR，反应条件如下：94℃预变性5min，94℃30s、68℃40s、72℃1min，循环30次，72℃延伸10min。PCR产物进行0.15g/L琼脂糖电泳分析，并对目标条带切胶回收。1.2.2PCR产物的克隆与测序　PCR产物经胶回收纯化后与pMD19-Tsimple载体用T4DNA连接酶16℃连接2h，转化DH5α感受态，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，菌落经蓝白班筛选，抽提质粒经NdeⅠ/NheⅠ限制性内切

8、酶双酶切鉴定，选取含目标片段的单克隆菌落并送上海英骏生物技术有限公司测序。1.2.3TATPTD-Ngb表达质粒的构建用NdeⅠ/NheⅠ限制性内切酶从阳性TA克隆载体上切下TATPTD-Ngb基因序列并胶回收，与同样酶切的含His-tag的pET28b表达载体16℃连接反应2h，构建表达质粒pET-TATPTD-Ngb，简称pETPN，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，挑选菌落、质粒抽提并经酶切鉴定筛选阳性单克隆，送上海英骏生物