ptd-gfp、ptd-edag融合蛋白质表达、纯化和初步应用

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1、中文摘要EDAG是一种与造血细胞分化调控密切相关的核蛋白质，对造血系统发育分化起重要调控作用，但对其作用机制尚缺乏深入的了解。因此，将EDAG蛋白质转导入造血干细胞内，研究其对造血干细胞增殖、分化、凋亡调控的影响，将对阐明其作用机制及应用前景具有重要意义。为将EDAG蛋白质有效导入造血干细胞，我们采用了基于蛋白质转导结构域(proteintransductiondomain，PTD)的蛋白质跨膜递送技术。它能将与之融合的蛋白质以一种浓度依赖的方式跨膜导入细胞，转导效率高，每个细胞内的蛋白质浓度近乎相同，且对细胞损伤较小。目前，其在医学研究领域中的应用已受到广泛

2、的关注。为优化跨膜递送技术各环节的条件，我们选择绿色荧光蛋白质(GFP)为研究对象，系统摸索了表达、纯化、转导等条件。我们首先采用DNA重组技术构建了PTD．GFP表达载体，共构建VP22．GFP、Tat．GFP、Tat．GFP．Tat、Tat-GFP．9R4种融合蛋白质原核表达载体，转染大肠杆菌BL21，经过摸索诱导剂浓度、茵密度、诱导时间等条件，得到各融合蛋白质的最佳诱导表达条件。在采用Ni-NTA亲和纯化柱纯化融合蛋白质时，我们尝试了两种纯化途径：一是天然蛋白质直接上柱纯化(Native条件)、二是先对表达蛋白质变性，然后纯化并复性(Hybrid条件)。

3、比较两种纯化路线所得蛋白质的跨膜转导能力发现，Hybrid途径纯化的融合蛋白质具有较强的跨膜转导能力，其中Tat．GFP．Tat蛋白质具有最强的活性。随后，我们分别构建了VP22．EDAG、Tat．EDAG、Tat．EDAG．Tat和Tat—EDAG．9R的原核表达载体，转染大肠杆菌BL21，经诱导均可表达目的蛋白质，除由于VP22．EDAG表达量很低，未获得纯化蛋白质外，其余得到相应的蛋白质，并得到Western．bolt的验证。本研究系统摸索了PTD融合蛋白质表达、纯化、转导等条件，’并构建了多种PTD．EDAG表达载体，经初步纯化获得Tat．EDAG．T

4、at融合蛋白质，为进一步研究奠定了基础。关键词：PTD；GFP；EDAGABSTRACTEDAGisanuclearproteinwhichplaysimportantrolesintheregulationofhematopoieticproliferation，differentiationandapoptosis．Butthemechanismofitisstillunknown．SoitisofgreatsignificancetotransduceEDAGproteinintohematopoieticstemcellstostudyitseffec

5、tontheregulationofhematopoieticproliferation，differentiationandapoptosis．AnovelproteintransductiontechniquePTD(proteintransductiondomain)wasemployedtoefficientlydeliverEDAGproteinintohematopoieticstemcells．GFPproteinwasutilizedtosystematicallyoptimizetheprocessesoftheproteintransduc

6、tiontechnique．FourPTD-GFPplasmids，includingVP22-GFP,Tat—GFP,Tat-GFP-TatandTat-GFP-9ILwereconstructedusingrecombinantDNAtechnology．ThenfusionproteinsexpressedinE．coliBL21werepurifiedbyNi-NTApurificationsystem．Toobtainthe‘optimaloutcomeofeachfusionprotein，wecomparedexpressioncondition

7、ssuchasinducerconcentration，theODandinductiontime．ThenativeconditionsandhybridconditionswerealsousedtodistinguishwhetherPTDfusionproteinpurifiedunderhybridconditionshasstrongertransmembraneabilityaspreviouslypostulated．TheresultsshowedthatfusionproteinspurifiedunderHybridconditionse

8、xhibitedstrongercel