加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织转化生长因子β1、结缔组织生长因子mrna影响的研究

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1、加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织转化生长因子β1、结缔组织生长因子mRNA影响的研究作者：郑旭锐，叶建红，周新颖，杨宇，孙守才【摘要】　　目的观察加味四逆散对肝脏转化生长因子β1（TGFβ1）、结缔组织生长因子（CTGF）mRNA的影响，探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法采用二甲基亚硝胺腹腔注射制备大鼠肝纤维化模型，加味四逆散灌胃给药，采用实时定量PCR技术检测各组大鼠肝组织TGFβ1和CTGFmRNA表达的水平。结果加味四逆散能明显降低肝纤维化大鼠肝组织TGFβ1和CTGFmRNA水平，与病理模型组比较有显著性差异（P<0.05）。结论加味四逆散能够降低肝组织TGF

2、β1和CTGFmRNA表达，从而发挥其抗纤维化的作用。【关键词】加味四逆散肝纤维化肝脏转化生长因子结缔组织生长因子　　加味四逆散是治疗慢性病毒性肝炎的有效经验方，既往的临床观察和动物实验研究已经证实该方具有良好的防治肝纤维化作用［1～3］。本实验采用二甲基亚硝胺（DMN）腹腔注射诱导肝纤维化大鼠动物模型，应用实时定量PCR技术检测大鼠肝组织中转化生长因子β1（TGFβ71）、结缔组织生长因子（CTGF）mRAN表达，探讨加味四逆散抗肝纤维化的作用机制。　　1材料　　1.1动物SD大鼠60只，雄性，清洁级，体重(180±20)g，由第四军医大学实验动物中心购进。　　1.2药

3、品及试剂加味四逆散煎剂由柴胡、枳壳、白芍、甘草、黄芪、丹参、桃仁等药组成，自陕西中医学院附院药房购进，经本院药物鉴定教研室鉴定无伪劣品。药物加水浸泡常规煎煮，过滤，水浴蒸发至每毫升含生药3.5g，置于4℃冰箱保存备用。二甲基亚硝胺(Sigma公司)。秋水仙碱（云南医药集团云南药业有限公司生产，批号：20020208）、TRIzolRegent（Invitrogen公司）、RT-PCRKit（大连宝生物工程有限公司）。　　2方法　　2.1动物模型制备大鼠在适应性饲养1周后随机选取12只作为空白对照组（A组），其余48只均用DMN（用生理盐水稀释至5mg/ml）以10ml/kg体

4、重腹腔注射，1次/d，每周连续3d，连续4周。　　2.27分组4周造模结束后，48只大鼠共死亡8只，死亡率为16.7%，将剩余40只造模大鼠随机分为：病理模型组（B组）16只，秋水仙碱组（C组）12只，中药治疗组（D组）12只。　　2.3给药A、B组：以生理盐水4ml/只灌胃；C组：以秋水仙碱0.01mg/kg体重灌胃；D组：以加味四逆散煎剂10ml/kg体重灌胃。以上各组用药均1次/d，连续用药30d后结束。　　2.4标本制作实验结束后取部分新鲜肝组织用10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，片厚5μm。　　2.5普通病理组织学观察病理组织学分级标准为［4］：“-”级:正常肝脏

5、或无明显胶原纤维增生；“±”级：胶原纤维增生，中央静脉和汇管区有少量纤维索放散延伸，但无间隔形成；“+”级：胶原纤维增生，中央静脉和汇管区结缔组织变厚，由此向四周伸出纤维索，形成不完全间隔；“++”级：胶原纤维大量增生，有个别菲薄的完全间隔形成（假小叶）；“+++”级：完全间隔较厚，假小叶大量形成。　　2.6RNA抽提和RT反应实验结束后取部分新鲜肝组织，按照Trizol试剂说明提取总RNA，加入20μlDEPC-treated水溶解，用紫外分光光度计260/280进行样品的浓度测定和质量鉴定，电泳证实总RNA的完整性。取2μg总RAN，按试剂盒(大连宝生物工程有限公司，RT

6、-PCRKit)说明书进行操作，合成cDNA。7　　2.7实时定量PCR（Real-timePCR）根据目的基因在Genbank中的已知序列用primerpremier5.0设计引物，由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列见表1。表1PCR中应用的引物序列（略）　　2.8统计学处理所有数据应用SPSS10.0软件处理,参数值用±s表示,组间比较采用ｔ检验（P<0.05为有显著性差异）。　　3结果　　3.1加味四逆散对大鼠症状表现的影响实验期间空白组大鼠一直精神状态佳，皮毛光滑密泽，大便正常，进食无异常。所有造模组大鼠，则出现不同程度的精神不振，反应迟钝，饮食摄水明显减少

7、，粪便稀薄，皮毛凌乱，缺乏光泽；治疗组于治疗3周后，大便逐渐干燥，进食、摄水增加，精神状态亦随之好转。实验过程中模型组大鼠死亡5只，可能为肝纤维化进行性加重而死亡。　　3.2加味四逆散对肝纤维化组织病理学的影响实验结束后，光镜下观察可见：空白对照组：HE染色见肝组织结构清晰，胶原纤维染色仅于汇管区和中央静脉有少许胶原纤维存在。模型组：HE染色见肝组织结构欠清晰7，汇管区及小叶内中度炎性细胞浸润；胶原纤维染色显示汇管区大量胶原沉积，呈较宽的条索状纤维深入肝小叶。各治疗组大鼠仅见轻度汇管区炎症，胶原纤维染色