加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织ⅰ，ⅲ，ⅳ型胶原影响的实验研究

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1、加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原影响的实验研究郑旭锐，孙守才，李长秦，胡建军【摘要】　　目的观察加味四逆散对肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的影响效果，从而探讨该方抗肝纤维化的机理。方法采用二甲基亚硝胺腹腔注射制备大鼠肝纤维化模型，加味四逆散灌胃给药，免疫组织化学方法检测分析各组大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的含量。结果加味四逆散能明显降低肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的含量，与病理模型组比较有显著性差异（P0.05）。结论加味四逆散可有效的减少肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的沉积，对肝纤维化有肯定的治疗作用。【关键词】加味四逆散

2、；肝纤维化；Ⅰ型胶原；Ⅲ型胶原；Ⅳ型胶原　　Abstract：ObjectiveThemechanismofChineseherbailpoundJIAN-inducedliverfibrosis.InJentgrouptheexpressionofcollagenⅠ,ⅢandⅣcollageninliverarkedlyreducedrespectivelyaccordingtoimmunohistochemistyanalysisasparedodelgroup（P0.05）.ConclusionThemechanismoftreat

3、inghepaticfibrosisentofdegradiationofcollageninliver.Jl兔抗鼠浓缩型，武汉博士德生物制品公司）。免疫组化试剂盒由第四军医大学免疫组化室提供。　　2方法　　2.1模型制备50只大鼠随机选取8只作为空白对照组（A），其余42只均用二甲基亚硝胺（用生理盐水稀释至5mg/ml）以10ml/kg体重腹腔注射，1次/d，每周连续3d，连续4周。　　2.2分组4周造模结束后，42只大鼠共死亡10只，死亡率为23.8%，将剩余32只造模大鼠随机分为：病理模型组（B）12只；秋水仙碱组（C）10只；中药

4、组（D）10只。　　2.3给药A、B组：以生理盐水4ml/只灌胃；C组：以秋水仙碱0.01mg/kg体重灌胃；D组：以加味四逆散煎剂20ml/kg体重灌胃。以上各组用药均1次/d，连续用药30d后结束。　　2.4标本采集与制备实验结束时，B组大鼠死亡2只，死因可能为肝纤维化未经治疗进行性加重导致肝硬化腹水而死亡。将其余存活大鼠断头处死取新鲜肝组织左叶，10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，片厚5μm。　　2.5观测指标及测定方法　　2.5.1一般表现精神、活动、饮食、皮毛、粪便等。　　2.5.2普通病理组织学检查将各组石蜡切片均行常规HE染

5、色及胶原纤维染色。光镜下观察。病理组织学分级标准为〔4〕：“-”级：正常肝脏或无明显胶原纤维增生；“±”级：胶原纤维增生，中央静脉和汇管区有少量纤维索放散延伸，但无间隔形成；“+”级：胶原纤维增生，中央静脉和汇管区结缔组织变厚，由此向四周伸出纤维索，形成不完全间隔；“++”级：胶原纤维大量增生，有个别菲薄的完全间隔形成（假小叶）；“+++”级：完全间隔较厚，假小叶大量形成。　　2.5.3肝组织CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ、CoL-Ⅳ免疫组化观察石蜡切片，免疫组化染色按试剂盒说明进行，SP染色法，DAB法显色。CoL-Ⅰ，CoL-Ⅲ，CoL-Ⅳ含

6、量以半定量的分级方式，根据显色深浅，分布范围及密度，分别划为4个等级〔5〕。0级：阴性；1级：较少，着色浅，高倍镜下明确阳性；2级：少量，着色中等，低倍镜下明确阳性；3级：大量，条索状或小片状分布，着色深。　　2.6统计学处理方法采用Ridit分析。　　3结果　　3.1加味四逆散对大鼠症状表现的影响实验期间空白对照组大鼠一直精神状态佳，皮毛光滑密泽，紧贴身体，大便正常，进食无异常。所有造模组大鼠，则出现不同程度的精神不振，反应迟钝，饮食摄水明显减少，粪便稀薄，皮毛凌乱，缺乏光泽；治疗组于治疗3周后，大便逐渐干燥，进食、摄水增加，精神状态亦

7、随之好转。　　3.2加味四逆散对肝CoL-Ⅰ，CoL-Ⅲ，CoL-Ⅳ的影响实验结束后免疫组化结果显示：空白对照组在汇管区及中央静脉等处可见CoL-Ⅰ，CoL-Ⅲ，CoL-Ⅳ沉积，但量极少，染色较淡，几乎为阴性。而模型组的汇管区及中央静脉等处可见大量CoL-Ⅰ，CoL-Ⅲ，CoL-Ⅳ沉积，数量极大，成条索状或小片状分布，着色深。中药组及秋水仙碱组肝组织Ⅳ型胶原沉积较模型组为轻，着色浅，大部分在高倍镜下才明确阳性。经统计学分析中药组及秋水仙碱组与模型组比较有显著性差异（P0.05）。中药组稍优于秋水仙碱组，但两者经统计无显著性差异（P>

8、0.05）。见表1。　　表1肝C0L-Ⅰ，C0L-Ⅲ，C0L-Ⅳ在各组大鼠中的分级结果（略）　　与B组比较，*P0.05；与C组比较，△P>0.05　　3.3加味四逆散对肝纤维化组织病理