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1、光化学疗法对人白血病细胞凋亡及Fas表达的影响作者：陈楠楠,黄世林,向阳,张德杰,张晨,张励【摘要】目的观察光化学疗法(PUVA)诱导人白血病细胞HL-60、K562、NB4凋亡时对Fas表达的影响。方法人白血病细胞分别与不同浓度补骨脂素(PSO)、接受或不接受长波紫外线(UVA)照射后共同培养,电镜下观察细胞超微结构改变,荧光定量PCR技术检测细胞Fas基因的表达,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率和Fas蛋白的表达,采用多因素方差分析法进行统计学处理。结果PUVA处理后的人白血病细胞超微结构出现明显的凋亡形态学改变；PSO、UVA照射及PUVA可使细胞凋亡率增加,可上调白血病细
2、胞Fas在基因、蛋白水平的表达,PUVA的作用显著强于前两者(P<0.01)。结论PUVA可诱导人白血病细胞发生凋亡,作用强于PSO及UVA照射。PUVA诱导白血病细胞凋亡的途径之一为上调HL-60细胞Fas基因表达。【关键词】光化学疗法；白血病；HL-60细胞；K562细胞；NB4细胞；细胞凋亡；FasKeywords：PUVAtherapy；leukemia；HL-60cells；K562cells；NB4cells；apoptosis；Fas9 补骨脂素(psoralen,PSO)具有光敏性质与抗肿瘤活性。本实验以不同浓度加波长为360nm,不同照射时间的长波紫外线(
3、ultravioletA,UVA)光照作用于人白血病细胞HL-60、K562、NB4,通过流式细胞仪检测细胞在光化学疗法(PUVA)后的凋亡情况；电镜下观察细胞超微结构改变；荧光定量PCR及流式细胞技术检测Fas在基因、蛋白水平的表达情况,以探讨PUVA法对人白血病细胞诱导凋亡的作用及部分作用途径。 1材料与方法 1.1细胞株人急性髓细胞白血病(FAB-M2)HL-60细胞、人红白血病细胞K562由大连医科大学惠赠；人急性髓细胞白血病(FAB-M3)NB4细胞为上海血液学研究所陈竺院士惠赠。 1.2药物及主要试剂9 PSO由大连理工大学及本院共同从补骨脂中提取和制备。二甲基
4、亚砜(DMSO)购自北京化工厂,RPMI1640培养液、胎牛血清为Gibco产品,小牛血清系杭州四季青生物材料工程公司产品,Trizol为美国GIBCOBRL产品,Fas基因表达试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司,鼠抗人Fas(CD95)单克隆抗体为美国CALTAG实验室产品。 1.3仪器和设备流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司,GLY-10型光量子血液平衡治疗仪由徐州华卫医疗设备公司研制,荧光定量PCR仪(DA7600型)购自中山大学达安基因股份有限公司。 1.4细胞培养HL-60、K562、NB4细胞分别常规培养于含10%小牛血清及10%胎牛血清的RPMI1640培养基
5、(含硫酸庆大霉素0.025U/mL)中,于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中进行连续培养。 1.5分组依据紫外线照射时间将实验组分为下列2组：长波紫外线照射0min组；长波紫外线照射5min组。 1.6细胞超微结构观察 收集浓度为5.0×105/mL,经PUVA处理的白血病细胞109mL,用PBS清洗2次,转入2.0mL离心管,离心(2000r/min)3min,弃上清,缓缓加入2.5%戊二醛2mL,4℃冰箱静置2h以上。磷酸缓冲液冲洗,锇酸固定,水洗、脱水,浸透、包埋,制定超薄切片,透射电镜下观察。 1.7光化学疗法24h后白血病细胞的凋亡情况 取浓度为4.0×105
6、/mL、处于对数生长期的白血病细胞株5mL,分别加入0、5、10、20、40μL的PSO,使其在反应体系中的终浓度分别为0、10、20、40、80μg/mL,放入石英比色皿中,在GLY-10型光量子血液平衡治疗仪(λ＝360nm)上以1J/m2辐射量边照射边震荡,照射时间分别为0、5min。处理后各实验组细胞继续培养24h后,收集5.0×105/mL细胞,用PBS洗2次,弃上清,加入100μL碘化丙啶(PI)染液,避光反应30min,加入PBS400μL,上机检测,并用Multicycle软件分析得出相应的细胞凋亡百分率。 1.8光化学疗法24h后白血病细胞Fas基因表达情况
7、①总RNA提取,采用Trizol一步法提取mRNA,按照试剂盒说明书操作。②cDNA合成,反应体系包括：5×反转录buffer4μL(含Mg2+＝4mmol/L),反转录酶(200U/μL)1μL,dNTPs(10mmol/L)0.5μL,上游引物0.4μL,下游引物0.4μL,DEPC水9.7μL,RNA模板4μL,总体积20μL；反应条件：37℃1h,95℃3min。③9将cDNA进行PCR扩增,反应体系包括：5×定量PCRbuffer10μL(含Mg2＋＝2mm
