白血病NB4细胞凋亡过程中Fas蛋白和基因的表达及意义.pdf

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1、山东医药2010年第5O卷第11期白血病NB4细胞凋亡过程中Fas蛋白和基因的表达及意义李俊武。张树梅，任海全，李桂云(1济钢集团有限公司总医院，济南250101；2山东省医学科学院基础医学研究所，山东省医药卫生肿瘤免疫与中药免疫重点实验室)摘要：目的探讨Fas蛋白及基因表达在三氧化二砷(AsO)体外诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞NB4凋亡过程中的作用。方法采用MTI'法检测As：0，作用后NB4细胞增殖情况，流式细胞仪检测Fas蛋白表达，RT—PCR法检测Fas基因表达。结果经As。O，作用后，细胞增殖受抑，细胞凋亡明显，Fas蛋白及基因表达均升高

2、。结论Fas蛋白及基因高表达在AsO诱导NIM细胞凋亡过程中起关键作用。关键词：NB4细胞；三氧化二砷；凋亡；Fas蛋白；Fas基因中图分类号：R733．7文献标志码：B文章编号：1002-266X(2olo)11-0060-02白血病是一类造血干细胞的克隆性恶性疾min离心，弃上清，加人二甲基亚砜150l／，孔，置微病⋯。1996年陈竺等首次报道三氧化二砷(As：0，)量板式振荡器震荡至甲躜颗粒完全溶解，酶标仪上可引起急性早幼粒细胞自血病(APL)细胞凋亡，检测A值，570nm为检测波长，630nln为参考波As20对APL细胞表现为双重作用，低浓度(0．

3、1—长，计算细胞增殖抑制率(％)=(对照组A值一实0．5la,moVL)诱导细胞部分分化，高浓度(>2．0验组A值)／对照组A值X100％。t~nol／L)则诱导细胞凋亡_2．3J。Fas／FasL途径是介1．3细胞形态观察以含10％胎牛血清的1640导细胞凋亡的主要受体途径之一。某些型别的白血培养液传代培养NB4细胞，将细胞浓度调整为1×病细胞可表达Fas抗原，且对Fas／FasL途径的致凋10／ml，加入终浓度为2ixmoL／L的As203，置37℃、亡作用敏感。Fas／FasL系统不仅与白血病的发生、5％CO、饱和湿度培养箱中培养，3d后将细胞离发展有

4、关，亦与白血病的治疗密切相关。2008年3心，用PBS重悬沉淀，取一滴细胞悬液制成涂片，姬月～2009年5月，我们将As0，作用于APL的NB4姆萨一瑞氏染色后显微镜下观察细胞形态。细胞，检测了Fas基因和蛋白的表达，旨在探讨Fas1．4Fas蛋白表达检测将细胞浓度调整为1x基因和蛋白在细胞凋亡中的作用。10／ml，加入终浓度为2~mol／L的As203，置37cC、1材料与方法5％CO饱和湿度培养箱中培养，3d后将细胞离心，1．1材料RpMI1640(Gibco)用双蒸水配制成含PBS洗2遍，加入FITC标记的Fas抗体5Ol，作用10％胎牛血清，100U

5、／ml青链霉素、300mg／LL．谷30min后流式细胞仪检测。以不加药细胞为阴性对氨酰胺的完全培养液。As：O，(Sigma)用10％NaOH照。溶解后用1640配成2mmol／L母液。Trizol提取液、1．5Fas基因表达检测采用RT—PCR法。2RT—PCR所需试剂及引物均购自TaKaRa公司和上txmol／L的As2O3处理细胞3d后，Trizol法抽提细海生物工程技术服务有限公司，PI购自晶美公司，胞总RNA。紫外分光光度仪检测所抽提RNA的浓Fas抗体购自BD公司。实验所用细胞株为急性早度和纯度合格后，采用MMLV—ReverseTranser

6、iptase幼粒白血病细胞NB4细胞株。逆转录酶将RNA逆转录为eDNA，以eDNA为模板1．2细胞增殖检测采用M1-r法。取对数生长期进行PCR反应，总体系为5Ol，PCR产物用1．2％细胞100l(5X10／m1)接种于96孔培养板，然后琼脂糖凝胶电泳，凝胶自动成像仪保存图像并定量分别加入终浓度为2．0IJ~-nol／L的As20，，设3复孔，分析，以目的条带与13．actin条带的相对光密度比值置37℃、5％CO饱和湿度培养箱中培养0、1、2、3来表示目的基因mRNA的表达水平。d，终止培养前4h加入5mg／ml溴化四甲基偶氮唑1．6统计学方法采用SP

7、SS11．5统计软件。对蓝(urn')10l／，孔，继续培养4h，2000r／min，10实验结果进行分析并行t检验，检验水准=0．05。6O山东医药2010年第5O卷第11期2结果型别的白血病细胞可表达Fas抗原，且对Fas／FasL2．1As03对NB4细胞增殖的影响2．0~mol／L途径的致凋亡作用敏感。目前临床采用的化疗方的AsO作用1d后NIM细胞增殖受抑，抑制率为法，大部分有诱导白血病细胞凋亡的作用，并且可通7．4％，2、3d后抑制率分别为35．8％、45．1％，而阴过Fas／FasL途径引起细胞凋亡，砷剂可能亦通过性对照细胞增殖依然旺盛。Fas

8、／FasL途径诱导细胞凋亡。2．2细胞形态未经AsO