dmc对凋亡白血病细胞mirna及相关基因表达研究

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DMC对凋亡白血病细胞miRNA及相关基因表达研究计：学位论文：31页表格：2个插图：6幅张文娟指导教师：谢书阳教授申请学位级别：硕士学位专业名称：肿瘤学论文提交日期：2012年4月论文答辩日期：2012年5月学位授予单位：大连医科大学学位授予日期：2012年6月评阅人：答辩委员会主席： 独创性声明f㈣必本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：丝年上月』日 目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3(一，)日IJ吾⋯”⋯⋯⋯“”⋯””“”⋯”⋯””””””””“⋯“””一”“一3(二)材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OO010OD⋯⋯⋯⋯15(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19三、文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21(一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27四、附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30五、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31 DMC对凋亡白血病细胞mjRNA及相关基因表达研究硕士生姓名-指导教师：指导小组：专业名称：张文娟谢书阳教授李有杰讲师肿瘤学摘要目的：探讨抗肿瘤药物去甲斑螯素(DMC)诱导慢性粒细胞性白血病(CML)细胞株(K562)凋亡相关基因和miRNA表达的变化。方法：DMC诱导K562细胞凋亡后，通过基因芯片技术筛选凋亡基因，检测miRNA及相关基因表达情况的变化，通过RT．PCR、实时定量PCR及ELISA等方法验证部分基因及其相关的miRNA表达变化关系。进一步应用基因信息分析软件对miRNA与凋亡基因的调控关系进行分析。结果：DMC致K562细胞凋亡组，基因芯片技术可检测到2300多种基因和290种miRNA的表达发生明显改变，抑癌基因RBl和P53表达明显增高，BCL2、E2F1和E2F3癌基因表达量显著降低；miR．16、miR．34a、miR．34b、miR．34c、miR一17及miR．125等表达量增高1．5倍以上，而miR-106和miR．150的表达降低约1．5倍。通过RT．PCR、实时定量PCR及ELISA法进一步检测到上述表达的变化。结论：miR-16／34a-c与BCL2、miR．17．5p与E2F1、miR．125与E2F3、miR．106与I氇1、miR．150与P53表达明显相关，这些miRNA可能调控上述癌基因和抑癌基因的表达。关键词：去甲斑螯素(DMC)白血病细胞凋亡miRNA基因表达 AstudyoftheexpressionchangesofapoptoticgenesandtheirrelevantmiRNAsexpressioninleukemiacellsinducedbyDMCMasterdegreecandidate：ZhangwenjuanSupervisor：ProfesserXieshuyangVice—supervisor：LiyoujieMajor：OncologyAbstraetobjective：ExploringtheexpressionchangeofgenesandtheirrelevantmiRNAsinapoptoticleukemiacellsinducedbyDemethylcantharidin(DMC)．Methods：AfterDMCinducingK562cellapoptosis，microarraysassessmentwasperformedtodetecttheexpressionchangesofgenesandmiRNAs．RT-PCR，real·timePCRandenzyme—linkedimmunosorbentassay(ELISA)wereperformedtoanalyzethecorrelationbetweengenesandtheirrelevantmiRNAs．Results：Microarraysresultsshowedthatmorethan2300genestranscriptsand290miRNAswereexpresseddifferentlyafterDMCtreatment．Tumorsuppressorgenes(RBIandP53)wereup-expressedandoncogenes(BCL2，E2F1andE2F3)weredown—expressed．miR一16，miR一34a,miR一34b，miR-34c，miR-17andmiR一125wereincreasedmorethan1．5times，whilemiR-20，miR一106andmiR一150weredown-expressedmorethan1．5times．RT—PCR，real-timePCR，andELISAanalysisalsosupposedthechanges．Conclusions：OurstudyshowedthattherewerenegativecorrelationbetweentheexpressionofmiR一16／34a-candBCL2，miR-17-5pandE2F1，miR一125andE2F3，miR-106andRB1，miR·150andP53．ThesemiRNAsmayregulatetheexpressionsoftheabovetumorsuppressorgenesoroncogenes．Keyword：DemethylcantharidinleukemiacellsapoptosismiRNAgeneexpression2 DMC对凋亡白血病细胞miRNA及相关基因表达研究硕士生姓名：指导教师：指导小组：专业名称：张文娟谢书阳教授李有杰讲师肿瘤学-i_1．_—L一刖茜去甲斑螯素(Demethylcantharidin，DMC)是近年来根据传统中药斑蝥体的主要抗癌成分一斑蝥素的化学结构，去掉2，3位甲基后人工合成的一种新型抗癌药物。它能够促进肿瘤细胞死亡，并调节机体免疫力。其抗肿瘤功效与传统中药斑螯素功能相似，而与斑螯素相比，DMC的副作用更小，大大降低了对泌尿系统的刺激，对肝肾功能也无明显影响，患者更易耐受。研究表明，DMC不但可抑制人肺癌、肝癌、肠癌细胞增殖、诱导人肠癌细胞凋亡IlJ，还可以诱导人乳腺癌细胞系MCF．7凋亡(21，并能抑制肿瘤细胞转移。慢性粒细胞性白血病(CML)是起源于多能造血干细胞的恶性克隆性疾病，是白血病中的一种常见类型，在各类白血病发病率中占第三位。其发病机制已经明确，90％以上CML患者的血细胞中出现Ph染色体，即t(9，22)(q34，q11)，并在分子水平导致BCR．ABL融合基因的形成，其编码的蛋白为P210。甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate，IM)是一种分子靶向药物，是目前临床上治疗CML的一线药物，它能够选择性抑制BCR．ABL阳性CML患者的白血病细胞的增殖并且能够诱导其凋亡。但目前已经有临床前和临床的数据显示，有些患者对IM产生原发性耐药，导致治疗效果不佳。加之IM价格昂贵，大多数患者经济上难以承受。寻找价格低、疗效好、毒副作用小的有效药物，是目前CML临床治疗对药物的迫切要求。microRNA简称miRNA，是近年来在真核生物细胞内发现的一类小分子RNA，在真核生物的基因表达、个体发育、细胞的增殖与分化、动物进化和人类疾病发生等各个方面都发挥着重要的作用131。近期的研究发现，多种肿瘤的发生与miRNA表达存在相关性，miRNA在肿瘤的发病机制中起着非常重要的作用，它们发挥着类似于癌基因或抑癌基因的功能。本研究拟通过观察DMC对慢性粒细胞白血病细胞株(K562)的杀伤作用，进一步检测肿瘤细胞相关基因及miRNA的表达情况，从而观察基因表达及相关miRNA在K562细胞凋亡中的作用，探讨DMC在CML治疗中的作用机理。3 材料和方法1、主要试剂(1)DMC采购自西安海欣制药有限公司；(2)四甲基偶氮唑盐(MTT)为美国Sigma公司产品；(3)胎牛血清、RPMI．1640培养基为Hyclone公司产品；(4)细胞凋亡检测试剂盒、RT—PCR试剂盒、PCR试剂盒、Trizol试剂盒等采购自宝生物工程(大连)有限公司；(5)琼脂糖购自Sigma公司；(6)ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；(7)DNALadder检测试剂盒购自南京凯基生物发展有限公司；(8)引物由上海赛百盛生物科技有限公司合成；(9)鼠抗人IgG抗体、羊抗兔IgG为北京中山生物技术有限公司产品；(10)兔抗人单克隆抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品。2、细胞株慢性粒细胞白血病细胞株(K562)采购自中科院上海细胞生物学研究所。3、主要实验仪器(1)荧光实时定量PCR仪(澳大利亚Corbett公司)(2)流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)(3)自动CCd凝胶成像系统(美国AlphaInnotech公司)(4)电泳仪(北京六一仪器厂)(5)台式冷冻离心机(美国杜邦公司)(6)荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)(7)C02培养箱(美国FormaScientific公司)(8)电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)(9)自动酶标分析仪(上海安泰分析仪器有限公司)(10)干式恒温器(BAYGENE生物技术有限公司)(11)．20。C和49C电冰箱(青岛海尔电器股份有限公司)(12)普通PCR仪(德国Eppendorf公司)(13)紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)(14)常温高速mini离心机(德国Eppendorf公司)(15)移液器(德国Eppendorf公司)(16)制冰机(日本SANYO公司)4 4、细胞培养(1)将液氮罐中冻存的K562细胞株取出，立即放入37。C的水浴中，不断震荡，使冻存液尽快融化，让K562细胞复苏，2000rpm离心2分钟；(2)然后采用加入10％胎牛血清的RPMI．1640培养基，将K562细胞株放在37。C、5％C02的饱和水汽二氧化碳培养箱中进行培养；(3)第二天观察细胞状态并更换培养液，进行细胞传代；(4)传代时首先将培养瓶中旧培养基倒掉，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞1次，再加25％胰蛋白酶6001xL，放入379C培养箱中2分钟；(5)镜下观察，可见细胞成为单个游离细胞，然后加入新鲜含10％胎牛血清的RPMI．1640培养基6001．tL；(6)收集瓶中液体，2000rpm离心2分钟；(7)弃去上清液，加入lmL新鲜含10％胎牛血清的RPMI．1640培养基，用移液器轻轻吹散细胞；(8)将细胞按照l：3分到新的50mL细胞培养瓶中，加入5mL含10％胎牛血清的RPMI．1640培养基进行培养；K562细胞每隔2天传代一次。5、DMC处理(1)待K562细胞生长至对数生长期时，取生长状态良好的细胞分入12孔板细胞培养皿中，细胞的浓度控制在5x105个／ml；(2)继续培养12小时后，用DMC进行处理；(3)将细胞分为五组，分别是：空白对照组(不加DMC)；DMC5rtg／ml组；DMC101．tg／ml组；DMC2099／ml组；DMC301．tg／ml组；(4)待药物作用O小时、12小时、24小时、36小时后分别取各组细胞进行实验。实验重复三次。6、MTT检测(1)细胞在不同药物浓度的培养皿中处理相应的时间后，向每孔细胞中加入MTT溶液109l；(2)继续培养4小时，收集细胞，4000rpm离心5分钟；(3)弃去上清液，每孔加二甲基亚砜(DMSO)1009l，摇匀；(4)使用酶标仪测定各孔光密度值(A)，波长使用570nlll，记录A值；按照下述公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率=(A对照组细胞—-A实验组细胞)／A对照组细胞。7、倒置显微镜下观察K562细胞在经过上述不同浓度的DMC处理后，在相应时间内，分别将细胞置于倒置显微镜下，观察对照组和各实验组细胞的形态变化。5 8、碘化丙啶(PI)染色检测(1)离心收集各孔细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗一次，弃去上清液；(2)加入预冷的70％乙醇，重新吹散细胞，放入冰箱(温度保持在4℃)固定24小时，再次离心收集细胞；(3)加入PI(20pg／m1)溶液lml，吹散后染色30分钟，用流式细胞仪(Beckman-Coulter，Inc，USA)检测细胞凋亡情况。9、DNAladder检测(1)2000rpm离心3分钟收集DMC作用36小时后的细胞；(2)采用DNAladder检测试剂按试剂盒说明书提取细胞中的DNA(参考分子克隆实验指南)；(3)用TE溶解后，再用1．5％的琼脂糖凝胶电泳，条件为80V，时间为45分钟；(4)凝胶成像仪内观察并拍照记录电泳结果，然后进行结果分析。10、mRNA表达谱芯片由北京博奥生物有限公司协助完成，简述如下：(1)应用Trizol(Invitrogen，Gaithersburg，MD，USA)一步法提取细胞中的总RNA，采用NucleoSpin@RNAclean．up试剂盒(MACHEI也Y-NAGEL，Germany)对总RNA进行柱纯化；(2)然后反转录合成cDNA，用PCRNucleoSpinExtractIIKit(MN)纯化，纯化后抽干；(3)将标记的DNA溶于80I．tl杂交液中杂交过夜：(4)杂交结束后，先在420C左右含O，2％十二烷基硫酸钠(SDS)、2x柠檬酸缓冲液(SSC)的液体中洗5分钟，然后在室温下用2×柠檬酸缓冲液(ssc)洗5分钟：(5)基因芯片用LuxScan10K／A双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进行扫描；(6)采用LuxScan3．0图像分析软件(CapitalBio公司)对芯片图像进行分析。11、miRNA表达谱芯片由北京博奥生物有限公司协助完成，简述如下：(1)Trizol一步法提取细胞中的总RNA，取50．100I_tgtotalRNA用PEG方法分离miRNA；(2)利用T4RNA连接酶标记方法141分别标记CU．cy3和CU．cy5(Dharmacon，USA)，然后再用无水乙醇沉淀，吹干后用于芯片杂交；(3)芯片用LuxScan10K／A双通道激光扫描仪进行扫描；(4)采用LuxScan3．0图像分析软件对芯片图像进行分析。6 12、RT．PCR检测基因和miRNA的表达(1)RT．PCR检测基因的表达：①用Trizol试剂盒，按照说明书提取细胞总RNA，取ll上gRNA逆转录获得总cDNA；②分别使用BCL2，E2F1，E2F3，P53和RBl的引物扩增目的基因，并且用引物13-Actin扩增相应基因作为参照基因，PCR条件为949C30s：退火30s(不同基因的退火温度参见表1)；72。C45s，各扩增30个循环；③产物经2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，应用紫外凝胶成像仪拍照观察。(2)RT—PCR检测miRNA的表达：①应用miRNA提取试剂盒提取小RNA，加尾后进行RT反应(I盯引物：5’-AACATGTACAGTCCATGGATGd(T)30—3’)：②分别使用miR．16，miR一17．5p，miR．20，miR．34a．c，miR．106，miR．125及miR．150的引物扩增相应的miRNA，并且用human5SrRNA引物扩增作为参照基因(上游引物见表2，下游引物为5’．AACATGTACAGTCCATGGATG．3’)。扩增条件为：949C30s；549C退火30s；72。C30s，30个循环；③然后用2％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并置紫外凝胶成像仪内观察以及拍照记录电泳结果。表1基因扩增所用的引物及退火温度表基因序Y05’_3’(退火温度)BCL2E2F1E2F3P5313-ActinBCL2-1：ttgccacggtggtggagga；BCL2-2：acagccaggagaaatcaaacag；Tm(530C)E2FI-1：ttgccaagaagtccaagaac；E2FI一2：tgtggtgagggatgaggg；Tm(55。C)E2F3·1：ttgaacaaggcagcagaa；E2F3-2：cagtttgaggtccagggt；Tm(530C)P53-1：atggaggagccgcagtca；P53-2：atgcaagaagcccagacg：Tm(530C)13-Actin1：ctacaatgagctgcgtgtggc；IB-Actin2：caggtccagacgcaggatggc；Tm(550C)RBI：aaccctcctaaaccactg；RB2：gggccattcrtactatcc；Tm(540C)7 表2扩增miRNA所用的上游引物表dxRNA序N5’-÷3’5SrRNAmiR-16GCCATACCACCCTGAACGmiR．17TAGCAGCACATAAATATrGGCGmiR．34aCAAAGTGCT『ACAGTGCAGGTAGmiR．34bTGGCAGTGTClvI’AGCTGGTTmiR．34eCAATCACTAACTCCACTGCCATmiR．106AGGCAGTGTAGmGCTGATmiR-125AAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGmiR．150TCCCTGAGACCCTTTAACCTCCCAACCCT丁GTACCAGT13、实时定量PCR检测基因和miRNA的表达(1)细胞中基因的检测：①经前述方法获得细胞中基因的eDNA；②然后检测BCL2，E2F1，E2F3，P53和RBl表达变化(引物序列及退火温度参见表1)。反应体系为20ul体系，包含上、下游引物，10x缓冲液、dNTP、高保真DNA聚合酶、SYBRGreenI染料等。定量反应条件为94。C20s；退火20s(不同引物的退火温度参见表1)；72。C20s，各扩增40个循环；③在每个循环的72。C时测定荧光量；④相关mRNA的表达量用样本／GAPDH比值表示。(2)细胞中miRNA的检测：①提取收集对照组和各实验组细胞内的miRNA；②用Poly(A)Polymerase试剂盒对提取的细胞内miRNA进行加尾反应；③应用M．MttLv反转录酶将加尾后的miRNA进行反转录，生成eDNA；④制备eDNA后，对miR．16，miR．17．5p，miR．20，miR一34a-e，miR．106，miR．125及miR．150进行检测，以human5SrRNA作为参照(本实验所采用的内参标准品为研究室已经制备好并保存的样品，并采用T．A载体克隆方案构建5SrRNA定量标准品)。反应体系为20ul体系，包含上、下游引物、10×缓冲液、dNTP、高保真DNA聚合酶、SYBRGreenI染料等。定量反应条件为94。C20s，54。C退火20s，72。C20s，各扩增36个循环；⑤在每个循环的729C时测定荧光量；⑥然后进行数据收集和生成标准曲线(由仪器自带软件Rotor．Gene6．0．41完成)，根据生成的标准曲线，软件还可为每一个样本生成一个测得的拷贝数；根8 据系统生成的样本拷贝数，以测定miRNA拷贝数／内参5SrRNA拷贝数表示样本中相应miRNA的相对量，从而对对照组和实验组细胞内miRNA的表达情况进行比较。14、ELISA法检测相关蛋白的表达简要步骤为：(1)在收集的细胞中加适量裂解缓冲液和PMSF(裂解液与PMSF的体积比为16：1)，冰上裂解20rain以上；12000rpm离心5min提取细胞总蛋白；(2)酶标板上每孔用100肛1、5mg／L鼠抗人IgG抗体包被，4。C过夜；(3)倾去包被液，用含有0．05％Tween的PBS溶液洗3次，每次在摇床低速摇晃5min；(4)加入10g／LBSA300弘I／孔，379c下封闭1h；(5)每孔加1001xl蛋白提取液，37。C温育1h；(6)倾去包被液，用含有0．05％Tween的PBS溶液洗3次，每次在摇床低速摇晃5rain；；(7)加100ttl兔抗人单克隆抗体BCL2、E2F1、E2F3、RBl及P53，379C温育2h；(8)倾去一抗溶液，用含有0．05％Tween的PBS溶液洗3次，每次在摇床低速摇晃5min：(9)每孔加1001al含1％BSAPBS(1：3000)稀释的羊抗兔IgG抗体，37。C，温育2h；(10)倾去二抗溶液，用含有0．05％Tween的PBS溶液洗3次，每次在摇床低速摇晃5min；(11)加入TMB显色液100“1，室温放置15rain；(12)加入50¨12mol／L硫酸终止反应，用酶标仪以450nm测定各孔吸光度值。15、统计学处理采用SAS软件进行方差分析及t检验，P