缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的研究

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1、缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的研究程阳1唐桥斐2赵丽妮31.沈阳医学院病理生理学教研室，辽宁沈阳110034；2.沈阳医学院沈洲医院耳鼻喉科，辽宁沈阳110034；3.沈阳医学院药理教研室，辽宁沈阳110034[摘要]目的探讨缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡和凋亡相关基因表达的相关机制。方法取体外新生大鼠心肌细胞作为试验样本，将其随即平均分配为四组，A组为对照组，B组为模拟缺血组，C组为缺血2h后再灌注1h组，D组为缺血持续3h组。采用TUNEL法对各组样本心肌细胞凋亡情况进行检测，并采用免疫组织化学法对Bcl-2/Bax基因的表达情况进行

2、检测。结果在心肌细胞I/R后，检测到明显的阳性凋亡细胞，同时D组和C组细胞凋亡指数明显高于B组，差异具有显著性（P<0.05）；免疫组织化学检测结果表明，Bax蛋白表达明显上调，Bcl-2基因表达明显下调。结论缺血和缺血再灌注均会造成心肌细胞凋亡，同时心肌细胞的凋亡同Bcl-2/Bax基因的表达之间存在一定的相互作用关系。[.jyqkail__"href="/cdn-cgi/l/email-protection"data-cfemail="dc387f66bfa5efedefefedef9cedeaeff2bfb3b1">[email 

3、;protected]。相关研究显示，心肌细胞在缺血再灌注过程中，有病理性细胞凋亡现象存在，是细胞死亡在缺血再灌注损伤过程中的主要形式[1]。近年来，关于缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡的研究多为整体研究，由于在体心肌的缺血再灌注模型受到多方面因素的影响，如体液调节、神经调节等，本次研究通过以体外大鼠新生心肌细胞作为研究对象，建立缺血再灌注模型，对缺血再灌注诱导心肌细胞凋亡和凋亡相关基因的表达进行研究[2]。本次研究于2013年3月—2013年9月期间通过构建大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤模型，通过TUNEL法对凋亡细胞进行检测，采用免疫组织化学法对相关凋亡基

4、因表达状况进行检测，以对缺血再灌注损伤过程中心肌细胞的凋亡现象进行研究探讨，并对相关基因的表达同心肌细胞凋亡之间的关系进行研究，旨在为临床研究提供可靠的证据。现将结果汇报如下。1资料与方法1.1一般资料采用BochringerMannheim公司生产的TUNEL试剂盒和荧光标记素，以小鼠抗大鼠Bcl-2、Bax单克隆抗体作为一抗，以生物素标记羊抗鼠抗体为二抗，以辣根过氧化物酶标记链亲和素作为三抗，以上均有北京中山公司提供。1.2方法1.2.1心肌细胞培养选取新生的健康SD雄性大鼠10只（由本地实验动物中心提供），体重（244±11.16）g，日龄1~

5、2d，将心脏在无菌条件下取出，剪裁心室组织得到若干1~3mm2均匀小块，使用0.25%胰酶对其进行4次消化处理，单细胞悬液并离心，并制备成单细胞悬液，在二氧化碳孵箱中培养45min后，吸出浓度较高的心肌细胞悬浮液，在小牛血清中培养，将细胞密度调整为5×105个/mL，在在6孔培养板中接种，培养36h后进行试验。1.2.2心肌细胞爬片的制备将制备好的浓度均匀的心肌细胞悬液于六孔细胞培养板中培养，72h后，改为在无Brdu的0.5%小牛血清DEEM中孵育36h并进行试验。1.3制备缺血再灌注模型缺血模拟：以模拟缺血液取代常规心肌细胞培养液，在厌氧罐中放入

6、培养板，将5%CO2混合95%N2充入瓶内，持续40min，以充分排出O2，在37℃环境中进行2h培养；再灌注模拟：在模拟再灌注液中进行缺氧心肌细胞1h培养。1.4心肌细胞鉴定采用免疫组织化学法联合形态学对心肌细胞进行鉴定。1.5实验分组将培养的原代新生大鼠心肌细胞随机分配为A组（正常对照组），B组（模拟缺血2h）、C组（缺血2h后给予1h再灌注）及D组（持续缺血3h），每组包括10例细胞爬片。1.6TUNEL染色按照相关操作方法，对各组细胞爬片进行凋亡细胞的检测，以不加TDT酶作为阴性对照，判定标准以核阳性为准，对凋亡指数进行计算。1.7免疫组织化

7、学法染色按照ABC法，对各组的心肌细胞爬片进行Bcl-2/Bax免疫组织化学染色。1.8荧光显微镜观察将各组心肌细胞制备成细胞悬液，将细胞密度调整为1×107个/mL，加入溴化乙锭、Y啶橙，混合均匀后制备载玻片，并在荧光显微镜下进行观察。1.9统计学方法本次研究采用统计学软件SPSS13.0对所有数据进行分析处理，采用平均值±标准差的形式表示计量资料，采用t检验对数据进行相关性检验，P<0.05时认为差异具有统计学意义。2结果2.1心肌细胞鉴定结果新生大鼠心肌细胞经过3d的培养，细胞贴壁，其中正常心肌细胞呈现不规则三角形或索性，细胞核居中并呈卵

8、圆形，胞体存在折光性明显，立体感较强，显微镜下可观察到明显伪足，搏动规则，频率80~100次/min，免疫组