新基因mipu1表达模式及抗心肌细胞凋亡作用的研究

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1、博士学位论文中文摘要摘要心肌缺血在临床上非常常见，如冠状动脉粥样硬化引起的冠脉阻塞，冠状动脉痉挛、体外循环下行开心直视手术引起的心肌缺血，以及心脏移植供体心的缺血等。短暂的心肌缺血．再灌注可以诱导许多具有细胞保护作用的基因表达上调，这些表达上调的基因是心肌内源性保护分子机制的重要组成部分。多种基因的表达已被证实在心肌缺血．再灌注时发生改变，并发挥保护作用。如抗氧化酶基因超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSHPx．1)等在心肌缺血．再灌注后表达上调，可发挥清除活性氧，保护心肌免受氧化损伤的作用；热休克蛋白家族成员HSP70、HSP27、

2、QB晶状体蛋白、HSP32等表达上调，可发挥修复受损蛋白、防止蛋白质聚集、降解变性蛋白及抗氧化等功能，增强心肌对损伤的抵抗力；缺血预适应可提高抗凋亡蛋白bcl．2的表达，而减少促凋亡蛋白Bax的表达，从而减轻心肌缺血．再灌注后的细胞凋亡发生率；而生长因子，特别是血管内皮生长因子(VEGF)的表达增加，有助于缺血心肌组织中微血管的新生及侧枝循环的建立，以改善缺血心肌的血液供应；其他如一氧化氮合酶、环氧合酶．2、脂肪酸结合蛋白、血管活性肠肽、醛糖还原酶等，都可以在心肌缺血．再灌注后表达发生改变，并发挥保护作用。本实验室袁灿博士采用生物信息学方法和5’RACE技术相结合，克隆

3、了一个大鼠心肌短暂缺血一再灌注诱导表达上调的新基因Mipul(GenBank登录号hY221750)，该基因定位于大鼠染色体lql2．1，其全长由五个外显子和四个内含子组成。MipulmRNA在心、脑表达较高，在其他组织表达较少，Mipul的开放阅读框由1824个核苷酸组成，编码含608个氨基酸的多肽链。Mipul是一个典型的C：H：型锌指蛋白，N一末端有一个KRAB结构域，C一末端有14个C。H：锌指基序。蒋磊等利用随机寡核苷酸文库筛选到了一个Mipul共同的DNA结合序列5’-TGTCTTATCGAA-3’，证明该序列是Mipul的特异性DNA结合位点，其中CTTA

4、为结合位点的核心序列，发现Mipul蛋白的C一末端的六个锌指为其与DNA结合所足够与必需，并证明Mipul是一个转录抑制因子。为了观察Mipul表达模式和可能的心肌保护功能，本研究首先纯化了大鼠Mipul原核表达蛋白，制备了兔抗鼠Mipul多克隆抗体，发现Mipul蛋白定位于细胞核，Mipul蛋白在脑及心肌组织中表达最高，肝、睾丸、肾、骨骼肌、卵巢博士学位论文中文摘要次之，脾、肺中未检测到。采用Northernblot、RT-PCR和Westernblotting分别于mRNA和蛋白质水平检测了Mipul在短暂缺血再灌注心肌组织及H202刺激心肌细胞中的表达模式，发现M

5、ipul在缺血．再灌注心肌组织表达增加，6h达到高峰，持续到12h；Mipul在H202刺激的H9e2细胞中表达亦显著增加，并呈时间与剂量依赖模式。心肌缺血／再灌注损伤、心肌梗塞等心脏疾病引起心肌细胞凋亡和坏死，而活性氧在心肌细胞的损伤中发挥重要作用。本研究进一步观察了Mipul对氧化应激所致心肌细胞损伤的可能保护作用，采用Mipul基因转染增加H9c2细胞中Mipul的表达及采用RNA干扰技术(RNAi)抑制H9c2细胞中Mipul的表达，采用活性氧H。02导致H9c2细胞损伤，采用流式细胞术观察细胞凋亡发生率，发现Mipul过表达可显著减少H。0。所致的细胞凋亡，降

6、低氧化应激状态下Caspase-3的活性，而Mipul—RNAi则显著促进H。02所致的细胞凋亡，并升高氧化应激状态下Caspase一3的活性。基于Mipul是一核转录因子，因此我们推测Mipul可能通过调控某些重要凋亡相关基因的表达而参与凋亡进程的调节。首先生物信息学技术对凋亡相关基因启动子区的序列进行了分析，发现多个凋亡相关基因的启动子区含有Mipul的DNA结合位点的核心序列，从中选取了3个具有代表性的凋亡相关基因Bax、Fas、Bcl．2，观察了Mipul对这3个基因表达的影响，并对其调控机制进行了探讨，获得了以下实验结果：(1)H9c2经H202刺激之后，Ba

7、x的表达升高，Mipul过表达使Bax蛋白的基础表达和诱导表达均降低，采用RNAi抑制Mipul表达使Bax蛋白的基础表达和诱导表达均升高；采用荧光素酶报告基因检测发现在正常状态及H202刺激下，Mipul均能够抑制Bax基因启动子的转录活性，MipuS．RNAi则能促进Bax基因启动子的转录活性；采用染色质免疫沉淀(CHIP)发现在正常状态及H202刺激下，Mipul能与Bax基因的启动子区结合，H202能增强其结合活性。(2)H9c2经H202刺激之后，Fas的表达升高，Mipul过表达使Fas蛋白的基础表达和诱导表达均降低，Mipu