arc及igf-1在as肉鸡中抗心肌细胞凋亡作用的研究

《arc及igf-1在as肉鸡中抗心肌细胞凋亡作用的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、华中农业大学博士学位论文ARC及IGF--1在AS肉鸡中抗心肌细胞凋亡作用的研究姓名：席照房申请学位级别：博士专业：临床兽医学指导教师：郭定宗20120615IGF．1及ARC在AS肉鸡中抗心肌细胞凋亡作用的研究摘要肉鸡腹水综合征(AscitesSyndrome，AS)是一种非传染性疾病，临床上以显著的腹腔积水、右心室肥大／衰竭、肺充血、水肿以及肝淤血为主要特征。尽管国内外学者对AS的发病机理进行了大量的研究，但仍未找到良好的防制方法。目前国内外对ARC在心脏疾病中的研究主要是针对哺乳动物心肌细胞，而且普遍认为ARC对哺乳动物

2、心肌氧化损伤、梗死、肥大均具有良好的保护作用。肉鸡腹水征发病过程中，心肌细胞明显肥大并伴有严重损伤，然而关于ARC对肉鸡心肌肥大＼损伤的保护及调控机制研究尚未见报道。为了从分子、细胞和整体的方面，探讨ARC在心肌细胞肥大、凋亡及腹水形成方面的抑制作用，揭示ARC蛋白与caspases．2、caspases．8、BAX和BCL．2的联系，阐明ARC对腹水肉鸡心肌细胞肥大、调亡和腹水形成的分子调控机制，进行了相关的研究。1．肉鸡腹水综合征模型建立及血液生化指标测定传统的观点认为腹水综合征肉鸡死于肺动脉高压诱导的右心衰竭，然而其确切

3、的导致右心衰竭的机制却不明了。现在有文献表明，活性氧具有损伤心肌细胞的能力，且是导致心肌细胞凋亡的主要因素之一。本实验将重点检测肉鸡腹水发生时，血清及血浆中活性氧的含量变化以及这种变化对心肌组织的影响。运用低温、缺氧、高能量的方法诱导肉鸡腹水(快速生长组)，来建立肉鸡腹水发病模型，以低能量组作为对照(低速生长组)。实验结果显示，和单纯的高能量及低温诱导相比，缺氧是更为有效的诱导腹水发生的手段，且检测数据显示在快速生长组中活性氧的水平和低速生长组相比显著上升。此外，在快速生长组的心肌组织凋亡水平检测方面，发现了高水平的心肌细胞凋

4、亡现象。因此实验结果提示，这种显著的活性氧含量变化可能是导致心肌细胞凋亡的主要原因。2．ARC基因克隆与原核表达以小鼠心脏组织提取的总RNA为模板，利用RT．PCR技术扩增出小鼠的ARC全长cDNA，然后将扩增产物重组到PMD．18T载体中，测得全基因的核苷酸序列。序列分析表明，小鼠ARC全长cDNA为663bp，编码221个氨基酸，于GenBank中的NM030152．4的序列完全相同。运用PCR及双酶切技术把目的基因克隆到pESATTM．E1表达载体，转化到宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后，成功表达华中农业大学2

5、012届博士学位论文出小鼠ARC融合蛋白。3．原代鸡胚心肌细胞培养、鉴定及活性测定如何获得高活力的心肌细胞，是研究肉鸡心肌细胞凋亡的重要基础。经过多年的研究积累，大鼠心肌细胞培养方法已经几近成熟，但鸡的心肌细胞培养方法却鲜有报道。本试验对比运用组织块贴壁和胶原酶消化法，处理11日龄的AA艾维茵鸡胚，获得鸡胚心肌细胞。通过形态观察，运用MTT法，检测分离纯化后及生长期的心肌细胞活性。发现两种方法都可获得足量的心肌细胞，但胶原酶消化法得到的细胞活力，更适合做为基础研究的细胞模型。4．IGF．1与ARC作用关系研究研究显示胰岛素样生

6、长因子(IGF．1)和ARC蛋白在调控心肌细胞凋亡方面有着显著的作用。尽管目前它们如何调控抑制细胞凋亡的机制并为被全面认知，但在心肌细胞中同样的抗凋亡功能，预示着它们之间存在着某些关联。我们的研究发现双氧水可以诱导降低ARC蛋白的表达水平，而IGF．1却能改变这种趋势。为了深入研究这种关联效应，运用免疫荧光和免疫印迹的方法，分析得出LY294002(P13K抑制剂)能阻断IGF．1对ARC蛋白的调控作用以及它对在双氧水存在下的心肌细胞抵抗凋亡能力。以上的实验结果证明，在双氧水诱导心肌细胞凋亡的模型中，IGF．1对心肌细胞的保护

7、能力是通过P13K途径来实现的。5．鼠源性的ARC蛋白在鸡胚心肌细胞中抗凋亡作用研究抗凋亡蛋白ARC和氧化应激及缺氧再灌注引起的损伤有密切关系。尽管具体的联系机制仍未被充分认识，但许多的研究表明外源性的ARC蛋白也具有抗凋亡能力。本研究重点探讨鼠源性的ARC蛋白在鸡胚心肌细胞中是否有抗凋亡能力以及其调控途径。为了研究鼠源性的ARC蛋白在过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡模型是否有抗凋亡能力，我们构建了重组pcDNA3．1／ARC质粒并将其转染到鸡胚心肌细胞中。运用实时荧光定量PCR和免疫印迹的方法检测ARC相关的基因(caspases

8、．2，．8，．3，and．9，andcytochromeC，bcl．2，andXIAP)的mRNA和蛋白表达水平。结果显示过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡能被转染的鼠源性的ARC蛋白所抑制。此外，外源性的ARC主要集中表达在心肌细胞的胞质，并且能显著下调caspases．2，．8，