myd88在ok432诱导树突状细胞成熟中的作用

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1、MyD88在OK432诱导树突状细胞成熟中的作用作者:倪秀雄刘丽燕刘永建曾真袁明洲陈玄【摘要】目的探讨小鼠骨髓树突状细胞(DCs)髓性分化蛋白88(MyD88)在OK432诱导DCs成熟中的作用机制。方法分离小鼠骨髓单核细胞(BMMCs),在含10%胎牛血清、重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子(rmGMCSF)、重组小鼠白细胞介素4(rmIL4)的培养体系中诱导培养,所得的细胞即为DCs。于培养的第5天,将细胞分为3组:对照组不加OK432和MyD88siRNA;OK432组加入终浓度为5μg/mL的OK432;RNA干扰组加入MyD88siRN

2、A12h后,再加入5μg/mLOK432刺激。半定量RTPCR法检测DCs中MyD88的表达;ELISA法检测各组DCs分泌肿瘤坏死因子α(TNFα)和IL12的能力;MTT法检测DCs体外刺激同种混合淋巴细胞增殖的免疫活性。结果OK432组DCs的MyD88高表达、TNFα和IL12释放明显增加并能诱导较强混合淋巴细胞反应,而用MyD88siRNA干扰后以上效应均降低(P<0.05)。结论靶向MyD88siRNA可明显抑制小鼠DCs中MyD88的表达和OK432诱导的DCs成熟,表明MyD88介导OK432诱导的DCs成熟。【关键词

3、】树突状细胞;RNA,小分子干扰;毕西巴尼;免疫耐受11树突状细胞(dendriticcells,DCs)是目前所知的体内功能最强的抗原提呈细胞(antigenpresentingcell,APC),能够显著刺激初始T细胞进行增殖,并具有激活免疫应答和诱导免疫耐受双重功能。OK432作为GMP级免疫调节剂可安全、有效地提高恶性肿瘤患者的生存率。Kanzaki等研究发现,OK432与常用的DCs成熟诱导剂脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子α(TNFα)相比,刺激健康人外周血单个核细胞来源的未成熟的DCs成熟的能力更强[14]。Toll样受体(Tolll

4、ikereceptors,TLRs)及其信号转导途径在调控DCs的成熟过程中起重要作用[5],而髓样分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)是TLRs信号转导途径中关键的衔接分子。在前期实验中,笔者采用OK432联合肿瘤细胞冻融抗原已成功的诱导了小鼠骨髓源性DCs的成熟[6],但其信号途径尚不清楚。本实验采用RNA干扰技术抑制小鼠骨髓DCs中MyD88的表达,进一步证实MyD88在OK432诱导DCs成熟中的作用。  1材料和方法  1.1材料雄性SPF级615小鼠,6~8周龄[大连医科大学实验动物中心,许可

5、证号:SCXK(辽)20040017];RPMI1640干粉培养基(美国GIBICO公司);胎牛血清(FCS,杭州四季青生物工程材料有限公司);重组小鼠白细胞介素4(rmIL4,美国R&D公司);重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子(rmGMCSF,美国R&D公司);OK11432(20081001,山东鲁抗制药公司);红细胞裂解液(139.6mmol/LNH4Cl、16.96mmol/LTris用1mol/LHCl调pH至7.2);MyD88siRNA、RNAimate(上海吉玛制药技术有限公司);Trizol(美国Invitroge

6、n公司);逆转录试剂盒(#K1621,MBIFerments公司);PCRMasterMix(北京天跟生化科技有限公司);MyD88引物(上海生物工程公司);ELISA试剂盒(美国R&D公司);MTT粉(美国Sigma公司)。  1.2方法  1.2.1获取骨髓前体细胞小鼠颈椎脱臼处死,无菌取双侧股骨和胫骨。去除附着的肌肉和结缔组织,剪掉骨两端,用PBS液冲洗骨髓腔,制成骨髓细胞悬液,200目尼龙网过滤,离心弃上清,1∶10的体积比加入37℃预温的红细胞裂解液,反复吹打混匀,室温5min,PBS离心洗涤2次,用含10%FCS的RPMI1640完全培养液

7、调整细胞浓度为2×106mL-1,接种于6孔板,培养孵育2h,吸去悬浮细胞,获得的半贴壁细胞即骨髓单核细胞(bonemarrowmononuclearcells,BMMCs)[6]。  1.2.2体外DCs的诱导培养和分组将贴壁的BMMCs置于含10%FCS、GMCSF(1000IU/mL)、IL4(500IU/mL)的RPMI1640完全培养液中,37℃11、体积分数为0.05的CO2条件下继续培养所得细胞即为DCs,分别于第3,5天各全量换液1次并补加细胞因子。于第5天时将细胞分3组:(1)对照组:培养过程中不加OK432和MyD88siRNA;(2

8、)OK432组:加入终浓度为5μg/

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