体外诱导生成树突状细胞的成熟度和激活性研究

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1、体外诱导生成树突状细胞的成熟度和激活性研究作者：刘晓霞贾力品乔俊红【摘要】目的:探讨人外周血单核细胞体外培养树突状细胞（dendriticcell,DC）的成熟度和激活性。方法:从健康成人外周血分离单核细胞（PBM），加入粒单系集落刺激因子（GMCSF）1000U/ml、重组白细胞介素4（IL4）500U/ml，体外培养7d。然后加入肿瘤坏死因子a(TNFa)100ng/ml，体外培养3d。培养流式细胞仪分别测定两次DC的主要组织相溶性复合体（MHC）Ⅱ类分子和协同刺激分子，分析其成熟度和激活度。结果:PBM经GMCSF和IL4诱导培养7d后，细胞成簇，表型

2、为CD83226%、CD86555%、CD11c361%、CD6432%、人类白细胞抗原（HLA）DR134%；加入TNFa培养3d后，细胞表型为CD83815%、CD86993%、CD11c988%、CD6434%、人类白细胞抗原（HLA）DR833%。结论:GMCSF和IL4诱导培养PBM7d，可获得大量不成熟DC，该体系有利于DC扩增，加入TNFa继续培养3d后，DC成熟度高，激活性好。【关键词】树突状细胞；体外培养；成熟度；激活性【ABSTRACT】Objective:Tostudymaturityandactivationofdendriticce

3、lls(DC)inducedfromhumanperipheralbloodmonocytes（PBM）.Methods:Themonocytescollectedfromnomalperipheralbloodl)andIL4(500U/ml)for7days,thenculturedl)for3days.MHCⅡandcostimulatorymoleculesofDCetryfortes,somaturity　andactivationofDC.Results:CD83、CD86、CD11c、CD64、HLADRexpressionsinPBMPBMa

4、ture,butthesysteminducementPBMaturityandactivation.【KEYaturity;Activation树突状细胞（dendriticcell,DC）是体内最强的抗原提呈细胞，免疫反应的产生首先是由抗原提呈细胞（APC）捕获抗原，经其加工处理后将抗原信号传递给T、B淋巴细胞，从而引发一系列的免疫应答。因此，APC是机体免疫反应的首要环节，能否进行有效的抗原呈递直接关系到免疫激活和免疫耐受的诱导。成熟的DC启动免疫应答，而不成熟的DC参与免疫耐受的形成。DC通常从骨髓CD34+细胞和PBM培养获得。在此，我们探索了从P

5、BM培养DC的成熟度和激活性的方法。1材料与方法11材料淋巴细胞分离液购自Sigma公司，丝裂酶素C购自Sigma公司，RPMI1640购自GIBCO公司，胎牛血清购自GIBCO公司，rhGMCSF、rhIL4、hTNFa购自RD公司，CD83、CD11c、CD64、CD86、HLADR、FITC标记兔抗鼠IgG荧光二抗购自华美生物工程公司。12方法121外周血单核细胞（PBM）的分离采集健康人外周血100ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，RPMI1640悬浮后种于24孔板，置于37℃，5%的CO2培养箱中，培养3h，弃去悬浮细胞，贴壁细胞即

6、为PBM，用于DC培养。122DC的培养含10%胎牛血清的RBMI1640悬浮PBM，1×105/ml细胞种于24孔板，2ml/孔，加入GMCSF1000U/ml、IL4500U/ml置于37℃，5%的CO2培养箱中，饱和湿度条件下培养7d，然后加入TNFa100ng/ml继续培养3d后，分别于7d和10d收集悬浮细胞核轻微贴壁细胞进行检测。123细胞形态学观察分别取培养3d和7d的细胞进行光学显微镜和电子显微镜的观察，对其形态结构进行分析。并在细胞培养期间进行细胞集落的观察。124细胞表型测定荧光素标记的CD83、CD86、CD11c、CD64、HLADR

7、等单克隆抗体，采用直接荧光法标记DC后，流式细胞仪分析细胞表型，至少分析5×103个细胞。125统计学方法两组间比较采用t检验。2结果21培养细胞的形态学在倒置显微镜下观察到,培养72h后的细胞呈圆形，散在分布，细胞无突起。以后细胞体积逐渐增大，细胞形态逐渐由圆形变为梭形、逗点状、蝌蚪状、星形或不规则形。在生长过程中，单个散在的细胞逐渐集聚成簇状细胞集落。开始集落较小，由3~5个细胞组成，以后集落逐渐增大，可达10个以上细胞。4d时，部分细胞脱落，集落变小。7d后细胞体积变大，突起明显增多，大多数细胞悬浮，贴壁较少。加入TNFa后继续培养，细胞脱落增多，脱落

8、细胞为成熟DC（图1）。图1DC体外培养不同时期的形