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1、XX大学毕业论文MyD88在0K432诱导树突状细胞成熟中的作用2014年6月25日MyD88在OK432诱导树突状细胞成熟中的作用作者：倪秀雄刘丽燕刘永建曾真袁明洲陈玄【摘要】H的探讨小鼠骨髓树突状细胞(DCs)髓性分化蛋白88(MyD88)4OK432诱导DCs成熟屮的作用机制。方法分离小鼠骨髓单核细胞(BMMCs),在含10%胎牛血清、重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子(rmGMCSF)、重组小鼠白细胞介素4(rmIL4)的培养体系屮诱导培养，所得的细胞即为DCso于培养的第5天，将细胞分为3组：对照组不加OK432和MyD88siRNA;O
2、K432组加入终浓度为5gg/mL的OK432;RNA干扰组加入MyD88siRNA12h后，再加入5pg/mLOK432刺激。半定量RTPCR法检测DCs屮MyD88的表达;ELISA法检测各组DCs分泌肿瘤坏死因子a(TNFa)和TL12的能力;MTT法检测DCs体外刺激同种混合淋巴细胞增殖的免疫活性。结果OK432组DCs的MyD88高表达、TNFa和IL12释放明显增加并能诱导较强混合淋巴细胞反应，而用MyD88siRNA干扰后以上效应均降低(P0.05)。结论靶向MyD88siRNA可明显抑制小鼠DCs屮MyD88的表达和OK432诱
3、导的DCs成熟，表明MyD88介导OK432诱导的DCs成熟。【关键词】树突状细胞;RNA,小分子干扰；毕西巴尼；免疫耐受树突状细胞(dendriticcells,DCs)是H前所知的体内功能最强的抗原提呈细胞(antigenpresentingcell,APC),能够显著刺激初始T细胞进行增殖,并具有激活免疫应答和诱导免疫耐受双重功能。OK432作为GMP级免疫调节剂可安全、有效地提高恶性肿瘤患者的生存率。Kanzaki等研究发现，OK432与常用的DCs成熟诱导剂脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子a(TNFa)相比，刺激健康人外周血单个核细胞来
4、源的未成熟的DCs成熟的能力更强[14]oToll样受体(Tolllikereceptors,TLRs)及其信号转导途径在调控DCs的成熟过程屮起重要作用[5],而髓样分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)是TLRs信号转导途径小关键的衔接分子。在前期实验小，笔者采用OK432联合肿瘤细胞冻融抗原己成功的诱导了小鼠骨髓源性DCs的成熟[6],但其信号途径尚不清楚。本实验采用RNA干扰技术抑制小鼠骨髓DCs>1'MyD88的表达，进一步证实MyD88在OK432诱导DCs成熟屮的作用。1材料和方法
5、1.1材料雄性SPF级615小鼠，6〜8周龄[大连医科大学实验动物屮心，许可证号：SCXK（辽）20040017];RPMI1640干粉培养基（美国GIBICO公司）;胎牛血清（FCS,杭州四季青生物工程材料有限公司）;重组小鼠白细胞介索4（rmIL4,美国RD公司）;重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子（rmGMCSF,美国RD公司）;OK432（20081001,ill东鲁抗制药公司）;红细胞裂解液（139.6mmol/LNH4Ck16.96mmol/LTris用1mol/LHC1调pH至7.2）;MyD88siRNA、RNAimate（上海吉玛
6、制药技术有限公司）;Trizol（美国Invitrogen公司）;逆转录试剂盒（#K1621,MBIFerments公司）;PCRMasterMix（北京天跟牛化科技有限公司）;MyD88引物（JL海生物工程公司）;ELISA试剂盒（美国RD公司）;MTT粉（美国Sigma公司）。1.2方法121获取骨髓前体细胞小鼠颈椎脱臼处死，无菌取双侧股骨和胫骨。去除附着的肌肉和结缔组织，剪掉骨两端，用PBS液冲洗骨髓腔，制成骨髓细胞悬液，200FI尼龙网过滤，离心弃上清，1:10的体积比加入37°C预温的红细胞裂解液，反复吹打混匀，室温5min,PBS离
7、心洗涤2次，用含10%FCS的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2x106mL-1,接种于6孔板，培养孵育2h,吸去悬浮细胞，获得的半贴壁细胞即骨髓单核细胞（bonemarrowmononuclearcells,BMMCs）[6]o1.2.2体外DCs的诱导培养和分组将贴壁的BMMCs置于含10%FCS、GMCSF（1000IU/mL）、IL4（500IU/mL）的RPMI1640完全培养液屮,37°C、体积分数为0.05的CO2条件下继续培养所得细胞即为DCs,分别于第3,5天各全量换液1次并补加细胞因子。于第5天时将细胞分3组：(1)
8、对照组：培养过程屮不加OK432和MyD88siRNA;(2)OK432组：加入终浓度为5gg/mL的OK432;⑶RNAi组：加入12h后给予OK4
