1木瓜蛋白酶性质测定

《1木瓜蛋白酶性质测定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、木瓜蛋白酶性质测定一、实验目的1、学习并掌握木瓜蛋白酶活性测定的基本原理。2、掌握影响木瓜蛋白酶性质的不同因素，如激活剂(如EDTA、半胱氨酸)，抑制剂、pH等。二、实验原理木瓜蛋白酶（Papain）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。它也具有脂酶活力。其分子量约为23000左右。木瓜蛋白酶是单条肽链，由211个氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有1个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和EDTA等；抑制剂有巯基试剂，包括重金属、羧基试剂和过氧化氢等。酪蛋白是一种蛋白质，它被

2、木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm处有吸收峰，根据测定275nm处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。三、仪器和试剂1、市售木瓜蛋白酶；2、仪器设备：磁力搅拌器（机）；离心机7000rpm（冷冻式）；紫外分光光度计；水浴槽；冰箱及常规玻璃仪器。四、实验步骤（一）激活剂（EDTA）对木瓜蛋白酶活力的影响1、试剂（1）3mg·mL-1木瓜蛋白酶液（用0.1mol/L的磷酸缓冲液，pH7.2配制）；（2）0.1mol·

3、L-1的磷酸缓冲液，pH7.2；（3）激活剂：用0.1mol·L-1磷酸缓冲液（pH7.2）配制含10mmol·L-1半胱氨酸，分别含有0，0.2，0.6，1.0，2.0，4.0mmol·L-1EDTA的6种混合液；（4）1%酪蛋白溶液：用0.1mol·L-1磷酸缓冲液（pH7.2）配制；（5）15%三氯乙酸（TCA）溶液。2、方法EDTA浓度（mmol·L-1）00.20.61.02.04.0管号010101010101酶液（mL）0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2EDTA（mL）1.81.

4、81.81.81.81.81.81.81.81.81.81.837℃水浴预热10min1%酪蛋白（mL）01.001.001.001.001.001.037℃水浴10minTCA（mL）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01%酪蛋白（mL）1.001.001.001.001.001.00摇匀，静置5min过滤（或离心）A275nm02.02802.03602.05502.13700.57800.082（二）抑制剂（过氧化氢）对木瓜蛋白酶活力的影响1、试剂配制浓度分别为0，0.25，0.5，1.0

5、，2.0，4.0mmol·L-1的过氧化氢溶液。2、方法过氧化氢浓度（mmol·L-1）00.250.51.02.04.0管号010101010101酶液（mL）0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2过氧化氢（mL）0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.237℃水浴预热10min1%酪蛋白（mL）01.001.001.001.001.001.037℃水浴10minTCA（mL）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01%酪蛋白（mL）

6、1.001.001.001.001.001.00摇匀，静置5min过滤（或离心）A275nm01.59501.50501.50001.44501.03501.330（三）不同pH值对木瓜蛋白酶活力的影响1、试剂pH5.0缓冲液0.1mol·L-1乙酸－乙酸钠缓冲液；pH6.0缓冲液0.1mol·L-1磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液；pH7.0缓冲液0.1mol·L-1磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液；pH8.0缓冲液0.1mol·L-1磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液；pH9.3缓冲液0.1mol·L-1硼砂－氢氧化钠缓冲液；2、用以上缓冲

7、液分别配制不同pH值的激活剂（1mmol·L-1EDTA）和1%酪蛋白溶液。缓冲液pH5.06.07.08.09.3管号0101010101酶液（mL）0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2EDTA（mL）1.81.81.81.81.81.81.81.81.81.837℃水浴预热10min1%酪蛋白（mL）01.001.001.001.001.037℃水浴10minTCA（mL）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01%酪蛋白（mL）1.001.001.001.001.00摇匀，静置5m

8、in过滤（或离心）A275nm00.03400.01100.11300.04300.023五、实验结果分析1、各实验组分析讨论实验结果，再由老师进行归纳总结。2、做好实验曲线绘制及数据记录。3、对该实验有哪些体会。1.答：激活剂（EDTA）对木瓜蛋