化学修饰木瓜蛋白酶的酶学性质研究

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1、第24卷第6期分子催化Vo1．24．No．62010年12月JOURNALOFMOLECULARCATALYSIS(CHINA)Dec．2010文章编号：1001—3555(2010)06-0529-08化学修饰木瓜蛋白酶的酶学性质研究熊亚红，吴巧儿，苏健鸿(华南农业大学理学院生物材料研究所，广东广州510642)摘要：采用邻苯二甲酸酐(PA)对木瓜蛋白酶进行了化学修饰，通过三硝基苯磺酸法、紫外光谱、荧光光谱及FT—IR光谱对修饰效果进行了初步表征，采用动力学方法考察了pH和温度对修饰酶水解活性和稳定性的影响，并计算了一系列动力学和热力学参数．实验结果表明：PA对木瓜蛋白酶的平

2、均氨基修饰度为43％，未对酶的活性基团一SH发生修饰，修饰酶较原酶的紫外吸收峰和最大荧光发射峰均发生蓝移，紫外吸收强度降低、荧光强度增大；PA修饰未改变木瓜蛋白酶的最适反应温度，但将其最适反应pH由7．0提高到8．5，且酶活力也提高了约20％；PA修饰有效提高了酶的催化水解效率和酶与底物的亲和力，如40cc、最适pH条件下修饰酶的转化数k(3．03S)和亲和力l／(1．70s·L·g)均较原酶的(2．28s～、1．15s·L·g)高，修饰酶催化水解反应的活化能Ea(25．4kJ·mol)较原酶的(29．3kJ·mol)低；PA修饰还明显提高了酶的pH稳定性和热稳定性，半衰期t延

3、长，酶分子的热变性活化能E由77．0kJ·tool提高到94．5kJ·mol～．可见PA化学修饰法是一种有效改善木瓜蛋白酶的催化性质和稳定性的方法．关键词：木瓜蛋白酶；化学修饰；稳定性；动力学；热力学参数中图分类号：Q55；0643．32文献标识码：A木瓜蛋白酶(papain，EC3．4．22．2)又称木瓜不同程度的提高，研究结果表明酶化学修饰是改善酶，其分子量为23000Da，等电点为9．5，由212个酶学性质和提高其应用价值的一种非常有效的措氨基酸残基组成的单肽链形成，分子中含有11个施．由于赖氨酸(1ysine，lys)残基末端的￡-NH赖氨酸(1ysine，Lys)残基

4、．木瓜蛋白酶在未成具有较强的亲核性，能够与许多亲电试剂在温和的熟的番木瓜果(Caricapapaya)表皮的白色乳汁中含条件下发生反应，有利于修饰过程中保持酶的活量丰富，是一种含巯基(一SH)的肽链内切酶，它性、减少酶活损失，因此，e—NH：成为化学修饰的具有广泛的底物专一性、良好的热稳定性及价格便首选官能团．邻苯二甲酸酐(phthalicanhydride，宜等优点，广泛应用于食品、医药、饲料、纺织及PA)是lys的一种专一性修饰剂，能够有效地改善染料等工业．由于天然木瓜蛋白酶作为一种天然酶天然酶的多种性能“．由于lys残基不是木瓜蛋剂在一些非温和条件下(如高温、高酸碱性、重

5、金白酶的活性中心部分，因此可以采用PA来对木瓜属离子等)其结构容易受到破坏而导致活性降低、蛋白酶进行化学修饰’．甚至完全丧失，而人们对木瓜蛋白酶的催化活性、酶催化反应的一些动力学和热力学参数对于研稳定性、底物选择性及pH适应范围等各种性能提究酶的催化反应是非常必要的．动力学参数可提供出更高的要求，因此对木瓜蛋白酶进行分子结构改一些酶催化反应机理方面的信息，而热力学参数可造以改善和提高其酶学性能，已经越来越引起人们提供一些酶变性机理方面的信息．人们通常采用微的重视．量量热法研究酶的热变性、采用尿素法或盐酸胍法酶的表面有许多游离的羟基、酚羟基、巯基、研究酶的溶剂变性，但近年来有人尝

6、试用动力学方羧基、氨基等官能团，可与一些化合物发生烷基法研究酶的稳定性，该方法简单、且不需使用价格化、酰化、醚化等反应．目前，文献报道已有多昂贵的微量量热仪．作者曾采用动力学方法研种酶经小分子修饰后，其催化活性或稳定性得到了究了一种新型核糖核酸酶¨和PA修饰猪胰脂肪酶收稿日期：2010-09-28：修回日期：2010—10—18．基金项目：华南农业大学“211工程”重点学科建设项Et(2009B010100001)；国家自然科学基金(青年科学基金项目)(20906034B0604)；广东省科技计划项目(2008B080701011)．作者简介：熊亚红，女，生于1976年，讲师，

7、博士，e—mail：xiongyahong@scau．edu．cn．分子催化第24卷(PA—PPL)的pH稳定性和热稳定性，得到了一以干酪素为底物，在40℃、pH7．0的条件下反应些有价值的动力学和热力学数据，但目前尚未见到10rain，以福林试剂显色，测定680nm的吸光度，关于木瓜蛋白酶变性的热力学研究．通过实验测得的酪氨酸tyr的标准曲线来计算出反我们采用PA对木瓜蛋白酶的lys残基进行了应产生的酪氨酸的量．将每分钟水解酪蛋白产生1化学修饰，并进行了初步表征，首次采用动力学方g酪氨酸定