基于细胞穿透肽技术对p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白功能的研究

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1、基于细胞穿透肽技术对p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白功能的研究作者：杨丽萍；刘志锋；黎永明；李志杰；姜勇　　(南方医科大学病理生理学教研室/广东省功能蛋白质组学重点实验室，广东广州510515)摘要：目的  构建基于TAT技术的p38MAPK蛋白转运系统并对导入细胞的融合蛋白的功能进行鉴定。方法采用亚克隆方法构建重组质粒pHis-TAT-p38和pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体，并诱导原核表达纯化融合蛋白；将这两种蛋白加入培养的ECV304细胞，在高渗刺激下，通过检测p38底物ATF2的磷酸化水平，以观察由TAT转导进入细胞H

2、is-TAT-p38及其无活性突变体对内源性p38活性的影响。结果酶切和测序结果表明，载体构建正确；SDS-PaGE凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋白；Westernblot表明，融合蛋白His-TAT-p38及其突变体能够以一种时间和浓度依赖性方式高效转导进入细胞；导入His-TAT-p38蛋白后，结果发现导入的野生型p38可增强内源性p38的功能，而无活性突变体则竞争性抑制了内源性p38MAPK蛋白的功能，从而阻止或抑制其对内源性底物ATF2的磷酸化，使得信号不能传递下去，进而抑制p38MAPK通路的活动。结论成功建立了基

3、于TAT的蛋白转运系统，并证实TAT能够以浓度和时间依赖方式高效转运蛋白进入真核细胞；进入细胞的His-TAT-p38和His-TAT-p38无活性突变体蛋白均具有较高的生物学活性，在高渗刺激作用下前者可以增加p38磷酸化水平，而后者则显著抑制p38信号通路的活性。关键词：I型人免疫缺陷病毒转录激活蛋白；p38丝裂原活化蛋白激酶；蛋白转导中图分类号：Q291  文献标识码：A  文章编号：1673-4254(2006)05-0553-05Cell-penetratingpeptide-basedfunctionalstudyofp38

4、MAPKYANGLi-ping；LIUZhi-feng；LIYong-ming；LIZhi-jie；JIANGYongDePartmentofPathophysiologyandGuangdongProvincialKeyLaboratoryofFunctionalProteomics,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,ChinaAbstract:ObjectiveToconstructap38MAPKproteindeliverysystembasedonTATproteinands

5、tudyitsfunctionsineukaryoticcells.MethodsRecombinantvectorspHis-TAT-p38andpHis-TAT-p38(AF)wereconstructed,andtworecombinantproteins,His-TAT-p38andHis-TAT-p38(AF),wereexpressedandpurifiedinE.coli.ThetwofusionproteinswerethenincubatedwithECV304cells,respectively.Thephosph

6、orylationofATF2wasdetectedtoassaytheeffectofHis-TAT-p38onendogeneiousp38activityafterthecellswerestimulatedbysorbitol.ResultsTheresultsofrestrictionenzymedigestionandDNAsequencingshowedthatthetworecombinantvectorswerecorrectlyconstructed.TherecombinantproteinsofHis-TAT-

7、p38andHis-TAT-p38(AF)wereisolatedandpurifiedbySDS-PaGE,andWesternblottingsuggestedthatHis-TAT-p38anditsmutantwithdualphosphorylationsitescouldenterthecellsefficientlyinatime-andconcentration-dependentmanner.His-TAT-p38wasfoundcaPableofincreasingtheactivityofendogenousp3

8、8inECV304cells,butHis-TAT-p38(AF)inhibitedthephosphorylationofATF2soastoblockthetransductionofp38signalPathway