复元胶囊对软骨细胞凋亡p38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的影响的论文

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1、复元胶囊对软骨细胞凋亡P38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的影响的论文【摘要】目的：观察复元胶囊含药血清对体外培养软骨细胞凋亡及p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路（p38mapk）的影响.方法:建立体外原代软骨细胞培养体系,制备复元胶囊含药血清,采用硝普钠（snp）诱导软骨细胞凋亡，并用复元胶囊含药血清以及p38mapk的特异阻断剂sb203580干预.透射电镜观察软骨细胞凋亡的超微结构，流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率的变化，比色法观察caspase3活性变化，免疫印迹技术（nitroprusside，snp）诱导的软骨细胞凋亡信

2、号传导过程中,p38mapk信号通路参与了凋亡信号的转导［4］.但目前国内外从信号转导的角度研究药物治疗骨关节炎的文献报道尚少.复元汤是由晒参、淫羊藿、鹿茸、黄芪、川芎、当归、枸杞子、三七等组成，是临床上长期用于治疗骨关节炎并有明显疗效的实验制剂.本实验建立软骨细胞体外培养体系，观察复元胶囊含药血清对snp诱导的软骨细胞凋亡的影响，并从信号转导的角度探讨其作用机制.　　1材料和方法　　1.1材料雄性3em=1∶1）培养基、优级胎牛血清（美国hyclone公司）；ⅱ型胶原酶（美国sigma公司）；胰蛋白酶（美国gibic公司）；总

3、蛋白提取试剂盒（中国升博生物公司）；p38mapk抑制剂sb203580（中国上海康成生物公司）；annexinvfitc试剂盒(中国晶美生物工程有限公司)；caspase3比色法检测试剂盒（美国biovision公司）；磷酸化抗体p38(美国cellsignaing公司)；p53抗体、蛋白内参βactin(美国santacruz公司)；pbs缓冲液、辣根酶标记兔抗山羊igg（中国北京中衫生物技术有限公司）；免疫印迹化学发光试剂（中国碧云天生物公司）；pvdf膜（美国millipore公司）；spus公司）；7500型透射

4、电镜（日本hitachi公司）；facsaria型流式细胞分析仪（美国bd公司）；凝胶成像仪（美国biorad公司）；elx800型酶标仪（德国gene公司）.　　1.2方法　　1.2.1软骨细胞的分离、培养及传代参照文献［5］的方法，将大鼠断颈处死后，无菌条件下分离股骨头，浸入含青霉素和链霉素的双抗水中漂洗3次，fd培养基中漂洗3次；将软骨剪成1mm3大小，移入2.5g/l胰蛋白酶中，37℃水浴箱中消化30min；胎牛血清终止消化，pbs缓冲液清洗2遍；再加入2g/lⅱ型胶原酶，37℃水浴箱消化，每30min轻轻摇荡1次，4h

5、后消化成絮状；1000r/min离心5min，弃上清，pbs缓冲液清洗2遍；加入含150ml/l胎牛血清的fd培养基制成细胞悬液，用200目不锈钢筛网过滤后接种于培养瓶中，置于37℃,50ml/lco2培养箱进行原代培养.倒置显微镜下观察细胞长满80%后传代培养，ⅱ型胶原免疫细胞化学染色鉴定细胞.　　1.2.2含药血清的制备〗雄性成年sd大鼠20只，随机分为复元胶囊组（10只）和对照组（10只）.复元胶囊组按meehrubner氏［6］公式给予10倍等效剂量药物，充分溶于生理盐水后灌胃；对照组给予等体积的生理盐水灌胃，每日2次

6、，连续3d.末次灌胃后2h心脏取血，4℃静置过夜，3000r/min离心20min，取上清，经0.22μm抽滤除菌后,分装,-20℃保存备用.　　1.2.3实验分组实验分为正常组（含150ml/l胎牛血清的fd培养基正常培养）、模型组（2mmol/lsnp+fd培养基）、空白血清组（2mmol/lsnp+含100ml/l空白血清的fd培养基）、中药组（2mmol/lsnp+含100ml/l复元胶囊含药血清的fd培养基）、抑制剂组（2mmol/lsnp+50μmol/lsb203580+无血清的fd培养基，预先用sb203580孵

7、育1h，再加入snp和培养基）、中药+抑制剂组（2mmol/lsnp+50μmol/lsb203580+含100ml/l复元胶囊含药血清的fd培养基，预先用sb203580孵育1h，再加入snp和培养基）.　　1.2.4透射电镜形态观察将snp诱导的软骨细胞用2.5g/l胰酶消化后进行收集，2000r/min4℃离心成细胞团块，用25g/l的戊二醛固定2h,10g/l四氧化锇再固定1.5h，经梯度丙酮脱水，环氧树脂浸透包埋，超薄切片机切片，电子染色，hitachi7500型透射电镜下观察.　　1.2.5流式细胞分析法检测细胞凋

8、亡选用第2代软骨细胞，2×105个/ml密度种植于6孔培养板中.培养24h细胞贴壁后，除正常组外，用不含血清的fd培养基继续培养24h使细胞同步化.按1.2.3所述进行分组、处理，继续培养48h后，收集培养上清和胰酶消化的细胞，离心后按fitcannexinv/