复元胶囊对软骨细胞凋亡p38丝裂原活化蛋白激酶信

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1、复元胶囊对软骨细胞凋亡P38丝裂原活化蛋白激酶信【摘要】目的：观察复元胶囊含药血清对体外培养软骨细胞凋亡及P38丝裂原活化蛋白激酶信号通路（P38MAPK）的影响.方法:建立体外原代软骨细胞培养体系,制备复元胶囊含药血清,采用硝普钠（SNP）诱导软骨细胞凋亡，并用复元胶囊含药血清以及P38MAPK的特异阻断剂SB203580干预.透射电镜观察软骨细胞凋亡的超微结构，流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率的变化，比色法观察Caspase3活性变化，免疫印迹技术（APK信号通路参与了凋亡信号的转导［4］.但目前国内外

2、从信号转导的角度研究药物治疗骨关节炎的文献报道尚少.复元汤是由晒参、淫羊藿、鹿茸、黄芪、川芎、当归、枸杞子、三七等组成，是临床上长期用于治疗骨关节炎并有明显疗效的实验制剂.本实验建立软骨细胞体外培养体系，观察复元胶囊含药血清对SNP诱导的软骨细胞凋亡的影响，并从信号转导的角度探讨其作用机制.　　1材料和方法　　1.1材料雄性3a公司）；胰蛋白酶（美国Gibic公司）；总蛋白提取试剂盒（中国升博生物公司）；P38MAPK抑制剂SB203580（中国上海康成生物公司）；AnnexinVFITC试剂盒(中国晶

3、美生物工程有限公司)；Caspase3比色法检测试剂盒（美国BioVision公司）；磷酸化抗体P38(美国cellsignaing公司)；P53抗体、蛋白内参βactin(美国SantaCruz公司)；PBS缓冲液、辣根酶标记兔抗山羊IgG（中国北京中衫生物技术有限公司）；免疫印迹化学发光试剂（中国碧云天生物公司）；PVDF膜（美国Millipore公司）；SPUS公司）；7500型透射电镜（日本HITACHI公司）；FACSAria型流式细胞分析仪（美国BD公司）；凝胶成像仪（美国BioRad公司

4、）；ELX800型酶标仪（德国Gene公司）.　　1.2方法　　1.2.1软骨细胞的分离、培养及传代参照文献［5］的方法，将大鼠断颈处死后，无菌条件下分离股骨头，浸入含青霉素和链霉素的双抗水中漂洗3次，FD培养基中漂洗3次；将软骨剪成1mm3大小，移入2.5g/L胰蛋白酶中，37℃水浴箱中消化30min；胎牛血清终止消化，PBS缓冲液清洗2遍；再加入2g/LⅡ型胶原酶，37℃水浴箱消化，每30min轻轻摇荡1次，4h后消化成絮状；1000r/min离心5min，弃上清，PBS缓冲液清洗2遍；加入含150m

5、L/L胎牛血清的FD培养基制成细胞悬液，用200目不锈钢筛网过滤后接种于培养瓶中，置于37℃,50mL/LCO2培养箱进行原代培养.倒置显微镜下观察细胞长满80%后传代培养，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色鉴定细胞.　　1.2.2含药血清的制备〗雄性成年SD大鼠20只，随机分为复元胶囊组（10只）和对照组（10只）.复元胶囊组按MeehRubner氏［6］公式给予10倍等效剂量药物，充分溶于生理盐水后灌胃；对照组给予等体积的生理盐水灌胃，每日2次，连续3d.末次灌胃后2h心脏取血，4℃静置过夜，3000r/mi

6、n离心20min，取上清，经0.22μm抽滤除菌后,分装,-20℃保存备用.　　1.2.3实验分组实验分为正常组（含150mL/L胎牛血清的FD培养基正常培养）、模型组（2mmol/LSNP+FD培养基）、空白血清组（2mmol/LSNP+含100mL/L空白血清的FD培养基）、中药组（2mmol/LSNP+含100mL/L复元胶囊含药血清的FD培养基）、抑制剂组（2mmol/LSNP+50μmol/LSB203580+无血清的FD培养基，预先用SB203580孵育1h，再加入SNP和培养基）、中药+抑制

7、剂组（2mmol/LSNP+50μmol/LSB203580+含100mL/L复元胶囊含药血清的FD培养基，预先用SB203580孵育1h，再加入SNP和培养基）.　　1.2.4透射电镜形态观察将SNP诱导的软骨细胞用2.5g/L胰酶消化后进行收集，2000r/min4℃离心成细胞团块，用25g/L的戊二醛固定2h,10g/L四氧化锇再固定1.5h，经梯度丙酮脱水，环氧树脂浸透包埋，超薄切片机切片，电子染色，HITACHI7500型透射电镜下观察.　　1.2.5流式细胞分析法检测细胞凋亡选用第2代软骨细

8、胞，2×105个/mL密度种植于6孔培养板中.培养24h细胞贴壁后，除正常组外，用不含血清的FD培养基继续培养24h使细胞同步化.按1.2.3所述进行分组、处理，继续培养48h后，收集培养上清和胰酶消化的细胞，离心后按FITCAnnexinV/PI试剂盒说明进行操作，采用FACSAria流式细胞分析仪检测，每个样本检测计数的细胞数量均固定为10000个，应用CELLQuest软件获取、分析输出实验数据.　　1.2.6比色法检测