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时间:2018-07-22
《基于细胞穿透肽技术对p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白功能的研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、基于细胞穿透肽技术对p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白功能的研究作者:杨丽萍;刘志锋;黎永明;李志杰;姜勇 (南方医科大学病理生理学教研室/广东省功能蛋白质组学重点实验室,广东广州510515)摘要:目的 构建基于TAT技术的p38MAPK蛋白转运系统并对导入细胞的融合蛋白的功能进行鉴定。方法采用亚克隆方法构建重组质粒pHis-TAT-p38和pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体,并诱导原核表达纯化融合蛋白;将这两种蛋白加入培养的ECV304细胞,在高渗刺激下,通过检测p38底物ATF2的磷酸化水平,以观察由TAT转导进入细胞H
2、is-TAT-p38及其无活性突变体对内源性p38活性的影响。结果酶切和测序结果表明,载体构建正确;SDS-PaGE凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋白;Westernblot表明,融合蛋白His-TAT-p38及其突变体能够以一种时间和浓度依赖性方式高效转导进入细胞;导入His-TAT-p38蛋白后,结果发现导入的野生型p38可增强内源性p38的功能,而无活性突变体则竞争性抑制了内源性p38MAPK蛋白的功能,从而阻止或抑制其对内源性底物ATF2的磷酸化,使得信号不能传递下去,进而抑制p38MAPK通路的活动。结论成功建立了基
3、于TAT的蛋白转运系统,并证实TAT能够以浓度和时间依赖方式高效转运蛋白进入真核细胞;进入细胞的His-TAT-p38和His-TAT-p38无活性突变体蛋白均具有较高的生物学活性,在高渗刺激作用下前者可以增加p38磷酸化水平,而后者则显著抑制p38信号通路的活性。关键词:I型人免疫缺陷病毒转录激活蛋白;p38丝裂原活化蛋白激酶;蛋白转导中图分类号:Q291 文献标识码:A 文章编号:1673-4254(2006)05-0553-05Cell-penetratingpeptide-basedfunctionalstudyofp38
4、MAPKYANGLi-ping;LIUZhi-feng;LIYong-ming;LIZhi-jie;JIANGYongDePartmentofPathophysiologyandGuangdongProvincialKeyLaboratoryofFunctionalProteomics,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,ChinaAbstract:ObjectiveToconstructap38MAPKproteindeliverysystembasedonTATproteinands
5、tudyitsfunctionsineukaryoticcells.MethodsRecombinantvectorspHis-TAT-p38andpHis-TAT-p38(AF)wereconstructed,andtworecombinantproteins,His-TAT-p38andHis-TAT-p38(AF),wereexpressedandpurifiedinE.coli.ThetwofusionproteinswerethenincubatedwithECV304cells,respectively.Thephosph
6、orylationofATF2wasdetectedtoassaytheeffectofHis-TAT-p38onendogeneiousp38activityafterthecellswerestimulatedbysorbitol.ResultsTheresultsofrestrictionenzymedigestionandDNAsequencingshowedthatthetworecombinantvectorswerecorrectlyconstructed.TherecombinantproteinsofHis-TAT-
7、p38andHis-TAT-p38(AF)wereisolatedandpurifiedbySDS-PaGE,andWesternblottingsuggestedthatHis-TAT-p38anditsmutantwithdualphosphorylationsitescouldenterthecellsefficientlyinatime-andconcentration-dependentmanner.His-TAT-p38wasfoundcaPableofincreasingtheactivityofendogenousp3
8、8inECV304cells,butHis-TAT-p38(AF)inhibitedthephosphorylationofATF2soastoblockthetransductionofp38signalPathway
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