大黄对重症急性胰腺炎大鼠ap一1

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1、大黄对重症急性胰腺炎大鼠AP一1活性的影响冯珍。熊文坚’。金飞。荆佳展。嵇贝纳。杨湘怡(上海市徐汇区中心医院，上海200031)摘要：目的探讨大黄对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠胰腺组织中激活蛋白-1(AP-1)活性的影响，探讨其治疗SAP的机制。方法选择100只SD大鼠，采用胆胰管逆行注射5％牛磺腰酸钠法建立SAP模型。将大鼠随机分为假手术组、SAP组、大黄治疗组；大黄治疗组建模后用10％大黄汤灌胃，建模后1、3、6、12h分别处死大鼠，取胰腺组织。用EMSA法检测各组大鼠胰腺组织中的AP-1活性，RT·PCR法检测胰腺组织中TNF-q、IL-6mRNA表达。结果与假手术组比较，SAP组各

2、时间点胰腺组织中AP-1活性明显升高(P<0．01)，且制模后1h即开始升高；与SAP组比较，大黄治疗组各时间点胰腺组织中AP．1活性、TNF—Of．、IL-．6mRNA表达明显下降(P均<0．05)。结论大黄治疗SAP的机制可能是通过抑制AP一1活性，从而减轻SAP的炎症反应。关键词：急性胰腺炎，重症；激活蛋白．1；大黄中图分类号：R576文献标志码：B文章编号：1002-266x(2010)49-0028-02急性胰腺炎(AP)是常见急腹症，其中约20％是重症急性胰腺炎(SAP)，患者病死率较高。近年研究表明，SAP的发生、发展与多种炎性介质有关，激活蛋白．1(AP一1)是炎症介质基因

3、转录的重要调控因子。中医用大黄治疗SAP历史悠久，且其疗效己得到肯定，但其治疗机理尚未阐明。2009—2010年，我们观察了大黄对SAP大鼠胰腺组织AP一1的作用，旨在探讨大黄治疗AP的作用机制。1材料与方法1．1药物、试剂牛磺胆酸钠购自Sigma公司；TNF-仪、IL-6RT—PCR试剂购自美国Promega公司，引物由上海康成生物公司合成；AP—l探针由上海之江生物公司合成；生大黄购自南京中医药大学国药堂。1．2试验方法1．2．1动物分组及模型制备清洁级健康雄性SD大鼠(南京大学实验动物中心提供)100只，体质量250—300g。随机分为假手术组、SAP组、大黄治疗组。大鼠术前禁食12

4、h，不禁水。用氯胺酮50m∥kg腹腔注射麻醉。SAP组、大黄治疗组开腹后寻找十二指肠，用丝线结扎胆胰管人十二指肠端，胆胰管人肝门端用小动脉夹夹闭；将连接微量注射泵的4．5号针头从胆胰管远端穿人，以0．2mL／min的速度向胆胰管内逆行推注5％牛磺胆酸钠溶液lml／kg；注毕5min，观察大鼠胰腺组织出现水肿、出血后，去除结扎丝线及动脉夹，逐层缝合腹壁。大黄治疗组在·通讯作者28制模后即予10％大黄汤2ml／100g灌胃1次。假手术组开腹后仅翻动十二指肠。三组大鼠于术后l、3、6、12h分批处死。1．2．2病理学检查大鼠处死后立即取其胰腺组织，用甲醛固定、HE染色后，采用光镜观察其病理变化。

5、1．2．3RT—PCR检测胰腺组织中的，INF—Ot、IL-6mRNA表达以TRIzol试剂盒抽提胰腺组织总RNA进行反转录，在PCR仪上进行扩增。反应条件为：95oC5rain，95cC10s，58℃15s，72℃20s，共35个循环。1．2．4EMSA方法检测胰腺组织中的AP．1活性①核蛋白提取：取胰腺组织100mg，用Dounee匀浆器匀浆，加入BufferA液lml、10％NP40—60出后，继续匀浆至液态；再以4℃、2000r／rain离心30s，上清为游离细胞和细胞核团，收集上清液。将上清液重悬，冰上膨胀15min，震荡10s。20000g离心10s，弃上清，加25～40出Bu

6、fferB液重悬细胞核。冰上放置20min并不断搅动，20000g离心5min，上清液即为核蛋白溶液。②核蛋白与DNA探针结合及电泳(总体积20一)：向小管内加入10×连接缓冲液2止，l∥山Polyl一，核蛋白lO峭，生物素标记的DNA探针2一，室温20rain，每20一结合反应液加5“上样缓冲液，吹打混匀。0．5×TBE非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒电压100V。电泳80min。1．3统计学方法采用SPSSl3．0统计软件，计量资料以；4-s表示，组间均数比较用t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。万方数据2结果2．1病理学检查假手术组胰腺小叶结构完整。SAP组胰腺充血、大片坏死，可见皂

7、化斑；胰腺小叶结构破坏，间质充血，大片出血及大量炎性细胞浸润。大黄治疗组胰腺组织病理变化明显减轻，皂化斑减少，胰腺少量出血，胰小叶结构破坏、腺泡细胞变性较轻。间质有少量炎性细胞浸润。2．2三组胰腺组织中TNF—Ot、IL-6mRNA表达见图l。与假手术组比较，SAP组及大黄治疗组各时间点胰腺组织中TNF．o【、IL-6mRNA表达均明显升高(P均<0．01)，且制模后1h即可升高，3h明显升高；与SAP组比较，大黄治疗组