携带人alpha突触核蛋白真核重组质粒构建及其sknsh细胞表达论文

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1、携带人alpha突触核蛋白真核重组质粒构建及其SKNSH细胞表达论文和青杜婷婷宋宁谢俊霞姜宏【摘要】目的构建携带人alpha突触核蛋白真核重组质粒，检测其在人神经母细胞瘤SKNSH细胞中的表达及对细胞存活率的影响。方法PCR扩增alpha突触核蛋白基因，产物纯化后与pcDNA3.1(+)载体进行连接反应,构建pcDNA3.1(+)/alpha突触核蛋白真核重组质粒。Lipofectamine法转染人神经母细胞瘤SKNSH细胞，RTPCR方法检测SKNSH细胞中alpha突触核蛋白mRNA的表达，四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对细胞存活率的影响

2、。结果酶切鉴定及基因测序证明人alpha突触核蛋白基因已被完整、正确地插入到pcDNA3.1(+)载体中。RTPCR结果显示该表达载体转染SKNSH细胞后，细胞内alpha突触核蛋白mRNA的表达水平明显增高，MTT方法检测结果显示该表达载体转染并未引起细胞存活率的改变。结论alpha突触核蛋白真核重组质粒构建成功,并可在SKNSH细胞内表达，且对细胞的存活率不产生任何影响.freelidofhumanalphasynucleingeneanddetectitsexpressioninhumanSKNSHneuroblastomacellsandit

3、seffectoncellviability.MethodsPCRedtoamplifytheentirefragmentofhumanalphasynucleingene,andtheamplifiedgenetheneemediatedgenetransfectionmethodanSKNSHcells.RTPCRanalphasynucleingeneedigestionandsequencingmethods.LevelsofalphasynucleinmRNAidtransfection.Hoidofhumanalphasynucleingene

4、issuccessfullyconstructedandexpressedinSKNSHcells.Thecellviabilityisnotaffected.AlltheseresultsestablishafoundationforafurtherstudyoftheroleofalphasynucleininthepathogenesyofParkinsondisease.KEY109和pcDNA3.1(+)载体均为本实验室保存。DMEM培养基购自Gibco公司，各种限制性内切酶、DNA连接酶购自中国宝生物工程(大连)有限公司。质粒小提试剂盒购自贝基生化科技有

5、限公司，胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和RT试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。琼脂糖购自Bioasia生物技术公司，Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。SKNSH细胞购自上海中国科学院细胞库。其他化学试剂为国产分析纯。1.2alpha突触核蛋白基因的PCR扩增根据GenBank中已收录的alpha突触核蛋白cDNA序列设计特异引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物:5′CTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATG3

6、′(XhoⅠ酶切位点)，下游引物:5′TCTAGAATCTCAAGAAACTGGGAGCAAAG3′(XbaⅠ酶切位点)。以SKNSH细胞全长cDNA为模版，PCR扩增alpha突触核蛋白基因获得所需片段。扩增片段大小为545bp。PCR循环条件:94℃变性1min，56℃复性1min，72℃延伸2min，共循环30次，最后72℃再延伸10min。取2μL扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳。1.3alpha突触核蛋白真核表达载体pcDNA3.1(+)/alpha突触核蛋白的构建及鉴定alpha突触核蛋白的PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化。将pc

7、DNA3.1(+)空载体采用XbaⅠ和XhoⅠ酶切、回收纯化后将目的基因(alpha突触核蛋白)和载体(pcDNA3.1(+))按3∶1的摩尔比混合，用T4DNALigase进行连接反应，16℃下16h以上，连接后24h内将连接产物转化入感受态大肠杆菌JM109中，挑取阳性单克隆，在含氨苄青霉素的L培养液中摇菌培养过夜，裂解大肠杆菌，提取、纯化质粒，用XbaⅠ和XhoⅠ双酶切连接产物，并用10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。将酶切鉴定正确的结果送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将构建好的鉴定无误的重组质粒命名为pc