携带人alpha突触核蛋白真核重组质粒构建及其sknsh细胞表达

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1、携带人alpha突触核蛋白真核重组质粒构建及其SKNSH细胞表达：和青杜婷婷宋宁谢俊霞姜宏【摘要】目的构建携带人alpha突触核蛋白真核重组质粒，检测其在人神经母细胞瘤SKNSH细胞中的表达及对细胞存活率的影响。方法PCR扩增alpha突触核蛋白基因，产物纯化后与pcDNA3.1(+)载体进行连接反应,构建pcDNA3.1(+)/alpha突触核蛋白真核重组质粒。Lipofectamine法转染人神经母细胞瘤SKNSH细胞，RTPCR方法检测SKNSH细胞中alpha突触核蛋白mRNA的表达，四甲基偶

2、氮唑盐(MTT)法检测其对细胞存活率的影响。结果酶切鉴定及基因测序证明人alpha突触核蛋白基因已被完整、正确地插入到pcDNA3.1(+)载体中。RTPCR结果显示该表达载体转染SKNSH细胞后，细胞内alpha突触核蛋白mRNA的表达水平明显增高，MTT方法检测结果显示该表达载体转染并未引起细胞存活率的改变。结论alpha突触核蛋白真核重组质粒构建成功,并可在SKNSH细胞内表达，且对细胞的存活率不产生任何影响，从而为进一步研究alpha突触核蛋白在帕金森病发病机制中的作用奠定了基础。【关键词】α突触核蛋白

3、;质粒;帕金森病[ABSTRACT]ObjectiveToconstructtheeukaryoticexpressionplasmidofhumanalphasynucleingeneanddetectitsexpressioninhumanSKNSHneuroblastomacellsanditseffectoncellviability.MethodsPCRedtoamplifytheentirefragmentofhumanalphasynucleingene,andtheamplifiedgenethenee

4、mediatedgenetransfectionmethodanSKNSHcells.RTPCRanalphasynucleingeneedigestionandsequencingmethods.LevelsofalphasynucleinmRNAidtransfection.HoidofhumanalphasynucleingeneissuccessfullyconstructedandexpressedinSKNSHcells.Thecellviabilityisnotaffected.Allthesere

5、sultsestablishafoundationforafurtherstudyoftheroleofalphasynucleininthepathogenesyofParkinsondisease.　　[KEY109和pcDNA3.1(+)载体均为本实验室保存。DMEM培养基购自Gibco公司，各种限制性内切酶、DNA连接酶购自中国宝生物工程(大连)有限公司。质粒小提试剂盒购自贝基生化科技有限公司，胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和RT试剂盒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。琼脂糖购自Bioasia生物技术公司，Li

6、pofectamine2000购自Invitrogen公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。SKNSH细胞购自上海中国科学院细胞库。其他化学试剂为国产分析纯。　　1.2alpha突触核蛋白基因的PCR扩增　　根据GenBank中已收录的alpha突触核蛋白cDNA序列设计特异引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物:5′CTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATG3′(XhoⅠ酶切位点)，下游引物:5′TCTAGAATCTCAAGAAACTGG

7、GAGCAAAG3′(XbaⅠ酶切位点)。以SKNSH细胞全长cDNA为模版，PCR扩增alpha突触核蛋白基因获得所需片段。扩增片段大小为545bp。PCR循环条件:94℃变性1min，56℃复性1min，72℃延伸2min，共循环30次，最后72℃再延伸10min。取2μL扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳。　　1.3alpha突触核蛋白真核表达载体pcDNA3.1(+)/alpha突触核蛋白的构建及鉴定　　alpha突触核蛋白的PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化。将pcDNA3.1(+)空载体采用X

8、baⅠ和XhoⅠ酶切、回收纯化后将目的基因(alpha突触核蛋白)和载体(pcDNA3.1(+))按3∶1的摩尔比混合，用T4DNALigase进行连接反应，16℃下16h以上，连接后24h内将连接产物转化入感受态大肠杆菌JM109中，挑取阳性单克隆，在含氨苄