正己烷致大鼠脂质过氧化及肝细胞dna损伤的实验研究论文

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1、正己烷致大鼠脂质过氧化及肝细胞DNA损伤的实验研究论文齐宝宁，易建华，唐国慧，苗江丽，郭剑锋【摘要】目的研究正己烷(nhexane)对大鼠的脂质过氧化作用和肝细胞DNA损伤的影响。方法40只雄性SD大鼠随机分成5组，即阴性对照组、75、150、300mg/kg染毒组和阳性对照组，每组8只。经腹腔注射染毒4周后，检测肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)的活力.freeleltingagarosegel,LMA)、正常熔点琼脂糖(normalmeltingagarosegel,NMA)、二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO

2、)、乙二胺四乙酸二钠盐(Na2ethylenediamine,Na2EDTA)、溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)均为美国Sigma公司产品。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSHPx)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和还原型谷胱甘肽(reducedglutathionehormone,GSH)测试盒均为南京建成生物工程研究所产品。1.1.3仪器DYYⅢ水平电泳槽，DYYⅢ33A电泳仪，NIKON荧光显微镜型及NIKONAFXⅡA型拍摄装置

3、，恒温水浴箱，DY89Ⅱ型电动玻璃组织匀浆器，CASP图像分析软件。1.2方法1.2.1动物分组及染毒将40只雄性SD大鼠随机分为5组，即阴性对照组、低剂量染毒组、中剂量染毒组、高剂量染毒组和阳性对照组(环磷酰胺)，每组8只，采用腹腔注射染毒5。阴性对照组仅用注射针穿刺腹腔，不注射任何试剂，低、中、高暴露组染毒剂量分别为75、150、300mg/kg，阳性对照组为50mg/kg，每日上午染毒1次，每周5d，连续4周。染毒过程中，所有大鼠均自由饮水、进食。每3d称体重1次，调整染毒剂量，记录大鼠的一般状况和体重变化。1.2.2单细胞凝胶电泳试验参照Singh等7方法略加改进。

4、主要步骤有：①单细胞悬液的制备。染毒结束后，用质量浓度为20g/L(2%)的戊巴比妥钠麻醉大鼠，剖开腹部，立即取出一5nm×5nm肝脏组织，装于盛有4℃磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsolution,PBS)的小烧杯中，洗去血液，然后加入RPMI1640培养液，用眼科剪剪碎，制成单细胞悬液。②胶板的制备。将预热50℃100μL质量分数为0.6%的NMA滴加到无水乙醇浸泡的磨砂载玻片上，迅速盖上干净的盖玻片，室温下静置10min使其凝固，为第1层凝胶；取10μL大鼠肝细胞悬液加入37℃80μL质量分数为0.5%的LMA中，混匀后迅速滴加到第1层胶上，立即盖上干

5、净的载玻片，室温下静置10min使其凝固，为第2层胶；最后在第2层胶上滴加预热37℃的质量分数为0.5%的LMA,盖上盖玻片，室温下使其凝固。③细胞裂解。移去盖玻片，将载玻片浸入新配制的细胞裂解液(2.5mol/LNaCl，100nmol/LNa2EDTA，10nmol/LTris，10g/L肌氨酸钠，临用前加体积分数为1%的TritonX100，10%DMSO，pH＝10)中，于4℃冰箱中裂解1h。④碱解旋。从裂解液中取出载玻片，用PBS冲洗2次，洗去过多的盐，晾干后置于水平电泳槽中，将新配制的电泳缓冲液(1mmol/LNa2EDTA，300mmol/LNaOH，pH=1

6、3，4℃预冷)倒入电泳槽中，液面约覆过胶面0.25cm左右，避光静置25min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋成单链DNA，使DNA断片在电泳场中易于迁移。⑤电泳。电压为25V，电流300mA，4℃环境下电泳20min。⑥中和与染色。电泳结束后，取出载玻片，吸水纸吸干电泳缓冲液，用0.4mol/L的TrisHCl(pH＝7.5)中和15min，然后每片载玻片上滴加30mg/L的EB水溶液50μL，盖上盖玻片，染色20min，即可观察。⑦阅片。24h内在荧光显微镜下观察，数码相机拍摄照片，每张玻片随机拍摄30个细胞，在电脑上用CASP彗星软件分析。1.2.3血清脂质过氧化指标

7、的测定染毒结束后，用质量浓度为20g/L(2%)的戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹部开U型口，暴露心脏，从心尖抽取5mL全血，置于试管中，37℃水浴2h，离心(3000r/min，10min)，分离血清检测GSH和MDA含量。MDA含量测定按硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid,.freelan微量法。1.2.4组织匀浆抗氧化酶活力测定立即取新鲜肝脏组织块(0.2-1g)，除去血液，滤纸拭干，称重，加入9倍重量的冷生理盐水，用组织匀浆机制成10%匀浆液，检测SOD和GSHPx活力。SOD活力测定按