糖尿病脑缺血再灌注大鼠海马胶质细胞凋亡研究

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1、糖尿病脑缺血再灌注大鼠海马胶质细胞凋亡研究：李俊君罗涛景丽马轶郭风英张建中【摘要】目的探讨糖尿病脑缺血再灌注时神经胶质细胞损伤加重的分子机制。方法96只成年SD大鼠随机分为4组：假手术对照组、正常血糖脑缺血组、糖尿病脑缺血组、PD98059预防糖尿病脑缺血组，每组24只。采用链脲佐菌素诱导糖尿病，双血管闭塞联合放血法建立糖尿病大鼠全脑缺血模型，运用HE染色、TUNEL方法，研究高血糖状态下脑缺血再灌注时和使用P-ERK1/2阻断剂PD98059后海马CA4、CA2神经胶质细胞的凋亡表达状况。结果糖尿病大鼠全脑缺血再灌注时，海马CA4、CA2区神经胶质细胞在缺血15min，再

2、灌注1、3h凋亡细胞数量增加，高于正常血糖脑缺血组大鼠(P<0.05)，使用P-ERK1/2阻断剂PD98059后，在缺血再灌注各时间点神经胶质细胞的凋亡细胞表达减少，低于糖尿病脑缺血组(P<0.05)。结论高血糖加重脑缺血再灌注时神经胶质细胞的损伤，高血糖诱导的ERK1/2磷酸化可能介导了神经胶质细胞的凋亡。【关键词】脑缺血;再灌注;糖尿病;高血糖;神经胶质细胞;细胞外信号调节激酶1/2;大鼠　实验研究证明，高血糖能够加重缺血再灌注时脑组织的损伤[1]。缺血性脑组织损伤主要表现为两种形式，即缺血性坏死和凋亡，而凋亡是缺血脑区迟发性神经细胞死亡的主要形式[2]。

3、神经细胞凋亡的确切机制尚不清楚，近年来发现MAPK家族成员细胞外信号调节激酶(ERK)通路在凋亡信号转导中具有不可替代的重要作用[3]，目前研究多集中在神经元上，研究显示糖尿病脑缺血再灌注时，神经元损伤加重，神经元凋亡细胞数量增多，MAPK家族成员ERK1/2在神经元表达上调。但是中枢神经系统的另一大类细胞-神经胶质细胞，在糖尿病脑缺血再灌注时损伤的形式、损伤的程度及其机制尚不清楚。本研究采用糖尿病大鼠双血管阻塞联合放血法建立高血糖脑缺血再灌注模型，对比观察缺血15min，再灌注1、3、6h海马区神经胶质细胞凋亡及其与MAPK家族成员ERK1/2激活的关系。　　1材料与方法

4、　　1.1材料　　健康成年SD大鼠，体重250～300g，由宁夏医科大学实验动物中心提供。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记(TdTmediateddUTPnickendlabeling，TUNEL)试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司;链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)、PD98059购自上海MERCK化工技术有限公司。　　1.2方法　　1.2.1分组及模型制作成年SpragueDa);(2)正常血糖脑缺血组(NCI);(3)糖尿病脑缺血组(DCI);(4)PD98059预防糖尿病脑缺血组(PD)，每组24只(雌雄各半)。Sham组只进

5、行手术操作，不注射STZ和诱导缺血。NCI组采用双血管阻塞联合放血法建立脑缺血再灌注模型;DCI组按55mg·kg-1腹腔注射2%链脲佐菌素柠檬酸盐缓冲液，在成功制备Ⅰ型糖尿病大鼠模型基础上，采用双血管阻塞联合放血法建立大鼠高血糖脑缺血再灌注模型;PD组高血糖脑缺血再灌注模型制作同DCI组，同时在糖尿病大鼠全脑缺血前30min静脉注射PD98059(3mg·kg-1)。脑缺血模型制备，3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，通过股动脉放血和双侧颈总动脉钳夹法诱导全脑缺血，采用BL-410生物机能实验系统监测脑电和血压变化，血压维持在45～50mmHg时，出现等电脑电图视为全脑缺血模型成功，

6、维持15min，除去双侧颈总动脉夹，并从右侧股静脉回输放出之血液为再灌注。各组分别在缺血15min，再灌注1、3、6h四个时间点，迅速开颅取脑，沿大脑正中矢状切面分为两半，其中一半用4%缓冲多聚甲醛固定用于HE、TUNEL染色,另一半脑组织用于其它研究。　　1.2.2常规HE染色光镜下观察各组不同时间点海马CA2、CA4区神经细胞、神经胶质细胞和血管的形态变化及分布情况。　　1.2.3TUNEL染色按照产品使用说明书进行，PBS代替一抗作为阴性对照，显微镜观察后，用二氨基联苯胺(DAB)显色。主要观察大鼠海马CA2区和CA4区凋亡的神经胶质细胞，细胞核内可见黄至棕黄色颗粒为

7、凋亡胶质细胞，细胞核内无黄至棕黄色颗粒为正常神经胶质细胞，高倍镜下用测微尺以0.01mm2为计数范围，计数整个海马CA2、CA4区凋亡神经胶质细胞数，然后取平均值分别作为该区数值列入分析比较。　　1.3统计学方法　　用SPSS12.5统计软件进行数据处理，所有计量资料均用均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1组织形态学改变Sham组各时间点海马CA2、CA4区神经元、神经胶质细胞形态基本正常(图1，见封2)。NCI组在缺血15min神经元、神经胶