羟基酪醇分离纯化及其对脑胶质细胞heb和脑胶质瘤细胞u251凋亡作用机理的研究

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1、摘要羟基酪醇(HT)，化学名为3,4一二羟基苯乙醇，是一种环烯醚萜类羟基芳族化合物，具有脂溶性和水溶性物理学特性的醇临二酚。在生物学方面已研究表明其具有抗氧化性、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗癌和抗菌等活性。它作为橄榄油中的主要成分而在地中海一带饮食健康中起到重要作用。脑胶质瘤是中枢神经系统临床常见疾病之一，它的治疗在世界医学属于疑难病症已被公认。因其病理学上行为展现为浸润性生长，虽然显微技术已广泛运用，但是用手术将其彻底切除仍达不到预期效果。的药物，但效果仍然不堪理想。新型、得期待。替莫唑胺是目前治疗脑胶质瘤较为可信高效、低毒的抗胶质瘤药物的研发仍值本研究旨从橄榄苦苷粗提物或

2、橄榄叶的盐酸水解液中分离纯化得到高纯度的HT，再进一步研究其是否有诱导脑胶质细胞HEB和脑胶质瘤细胞U251凋亡的效果，从而探讨其抗脑胶质瘤的生物学活性。这将为橄榄叶及富含橄榄皂苷相关资源的合理充分利用提供有力的实验依据和理论基础，为HT在肿瘤预防与治疗等运用方面开拓新视野。以下为实验方法及结论概述：(1)用0．5M的HCl水解橄榄苦苷粗提物，水解条件为时间15min、温度105℃、料液比1／30，水解液经过离心除杂后，设计正交实验筛选出ZTCI+I．II天然澄清剂的最佳澄清条件(B组份和A组份的最终质量浓度分别为0．2g。L～，0．1g．L～；水浴温度为100℃；水浴时间为2h

3、)，然后以此条件对水解液做澄清实验，以澄清后离心所得的干沉淀为依据，发现澄清三次效果较佳，用筛选出最佳的萃取剂乙酸乙酯萃取澄清液，浓缩后得到质量分数为43．38％的HT，回收率达到82．35％。(2)用O．5M的HCl水解橄榄叶粉末，水解条件、澄清条件和澄清次数与(1)相同，用13种大孔树脂分别吸附澄清液中的有效成分，筛选出较佳的树脂为LX．18C，然后用此种树脂筛选澄清液吸附量，结果为lgLX-18C能吸附5mL，吸附率高达90．14％。最后用LX．18C吸附分离后的样再继续用ODS填料在．jid(TATMpurifier系统中进一步分离。最后检测发现能够从橄榄叶中分离得到纯度

4、为47．82％的HT，但回收率仅为1．11％。摘要(3)选择白藜芦醇(Res)作为HT是否具有诱导HEB(U251)细胞凋亡作用特性的阳性对照药物，通过MTT实验检测HT对HEB(U251)细胞活力的影响，从而得到48h下的半抑制浓度(IC50)。显微镜和电镜下观察HT作用HEB(U251)细胞形态和结构的变化，DNA凝胶电泳检测HT作用HEB(U251)细胞DNA片段化程度。流式细胞术检测HEB(U251)细胞凋亡率大小和周期阻滞随不同浓度HT作用后的变化情况以及WesternBlotting检测凋亡相关蛋白Bcl．2和Caspase．3随不同浓度的HT作用后表达影响情况。结果

5、发现HT对HEB细胞48h的IC50为0．846mM；而对U251细胞48h的IC50为0．410mM。HEB(U251)细胞在被HT作用后，形态趋于圆形、异染色质边集化、核固缩、微绒毛减少及胞质有空泡等现象。DNA也随着HT浓度的增加而呈现明显的片段化。随着HT浓度的增加，HEB(U251)细胞凋亡率也逐渐增多，HEB(U251)细胞被阻滞在S期，具有显著性差异(P

6、度。但仍不能达到预期用于后续细胞实验的纯度。通过一些凋亡检测方法发现HT具有诱导HEB(U251)细胞凋亡的特性，而且与HEB细胞相对比，低浓度的HT就能诱导U251细胞凋亡。但其诱导强度比同等浓度下的Res要弱很多，因此并不适合把它做为抗脑胶质瘤药物来考虑。关键词：羟基酪醇；白藜芦醇；分离纯化；U251细胞；HEB细胞；凋亡IIAbstractABSTRACTHydroxytyrosol(HT)，whichisalsocalled3,4-Dihydroxyphenylethanol，isoneofsecoiridoidshydroxyaromaticcompounds．Itis

7、anortho-diphenolandholdslipidandwatersolubility．Itshowedthatanti-oxidizability,aiti-plateletaggregation,anti—atherosclerosis，antibiosisandanticancerandSOonbioactivities．Itplaysanimportantroleinthemediterraneandietbecauseitisamaincompositionof