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1、圣和散对脑胶质瘤细胞诱导分化的研究夏跃胜王建华吴永忠王欢【关键词】圣和散；,,,脑胶质瘤；,,分化 摘要：目的观察圣和散对脑胶质瘤C6细胞株体外生长及诱导分化的作用。方法用圣和散处理脑胶质瘤C6细胞，采用甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测圣和散对C6细胞增殖的抑制作用,以免疫组化SABC法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和c-myc表达。结果圣和散可显著抑制C6细胞体外增殖，并呈现时间、剂量依赖性。在终浓度为5mg/ml和10mg/ml时,对C6增殖的抑制率达(49.62±1.13)%和(69.38±1.42)%，明显优于对照组（P＜0.01）。免疫组化可见SHP组较对照组GFA
2、P表达明显增强，c-myc表达下降。结论圣和散对胶质瘤C6细胞系的增殖有明显的抑制作用，能通过诱导分化降低脑胶质瘤细胞恶性程度。 关键词：圣和散；脑胶质瘤；分化 InducingDifferentiationEffectofShenghePoaCells Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectsofShenghePoaC6celllineinvitro.MethodsBraingliomaC6cellline(MTT)easuretheleveloftheproliferationofC6culturedycofC6cellsmuno
3、histochemicalSABCmethod.ResultsTheproliferationofC6e-dependentmanner.Theinhibitoryrateg/mland10mg/ml,paredycdecreasedsignificantlyinC6cellsculturedalignantdegreebyinducingdifferentiationoftheC6cells. Keya;Differentiation 脑胶质瘤是常见的脑肿瘤之一，由于其位置的特殊性和肿瘤本身的高侵袭性，手术难以彻底切除，术后复发率高，即使联合放化疗,预后仍很差〔1,2〕。圣和
4、散是我院多年来用于治疗脑胶质瘤的方药，它能否抑制脑胶质瘤增殖，诱导其分化是本实验研究的目的。 1材料与方法 1.1材料鼠源性胶质细胞瘤C6细胞系（引自第四军医大学西京医院）;DMEM细胞培养基（美国Gibco公司）;甲基噻唑基四唑(MTT)、碘化丙锭（PI）、GFAP单抗、免疫组化SABC试剂盒（美国Sigma公司）；c-myc单抗（英国Novo公司）;酶联免疫仪（华东电子管厂DG5031型）。 1.2方法 1.2.1细胞培养鼠源性胶质细胞瘤C6细胞常规培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml庆大霉素的DMEM培养液中，在37℃、5%CO2、饱和湿度培
5、养箱内传代培养。2d换液1次，0.25%胰酶消化，传代。 1.2.2药物处理将中药SHP（主要含党参、太子参、玄参、炒白术、薏苡仁、土鳖虫、白花蛇舌草、肉苁蓉、蟾蜍、甘草）经多酶乳化流程水提后〔3〕，喷雾得干燥粉末，取适量磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，上清用0.22μm的滤过膜过滤，配制成浓度10mg/ml的药液。 1.2.3细胞生长抑制测定取对数生长期C6细胞,用0.25%胰蛋白酶消化,10%胎牛血清DMEM培养基配制成104个/ml单细胞悬液,取100μl(含103个细胞)加入96孔板中,培养4h,细胞贴壁,分为实验组(加SHP,终浓度分别为2.5,5,10mg/ml)和空白
6、对照组(不加SHP),培养于37℃,5%CO2培养箱中培养,72h后,加入MTT10μl/孔,继续培养4h,吸去培养液,加入DMSO100μl,将培养板振荡5min,20min以内以570nm为测试波长,630nm为参考波长,在全自动酶标仪上读取各孔吸光度(A值),每组8孔。肿瘤细胞生长抑制率的计算：抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。 1.2.4免疫组化SABC染色法检测GFAP和c-myc表达在规定培养时间取SHP处理组和对照组的C6细胞爬片,洗涤后经纯丙酮室温固20～30min,蒸馏水洗;纯甲醇加H2O2至0.5%,室温浸泡30min。蒸馏水洗3
7、次；滴加正常山羊血清封闭液,室温20min后甩去多余液体；分别滴加适当稀释的一抗(1∶100)GFAP(小鼠IgG)和c-myc单抗,37℃1h,0.1mol/LPBS洗2min3次;滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃20min,0.1mol/LPBS洗2min3次;滴加试剂SABC,37℃20min,0.1mol/LPBS洗5min4次;室温下DAB显色,蒸馏水洗涤,在400倍光镜下观察,阳性反应细胞核呈棕色或棕黄色。PBS代替一抗作空白对照。每张切片随机抽取视野
