抑癌基因fhit对肝癌细胞huh7体内外生长的影响

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1、抑癌基因fhit对肝癌细胞HuH7体内外生长的影响：许荣华，郑武平，夏立平【摘要】　　目的：研究外源性人脆性组氨酸三联体（fhit）的高表达对人肝癌细胞HuH7体内外生长的影响。方法：构建一个包含人脆性组氨酸三联体基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/fhit，转染fhit阴性的人肝癌细胞HuH7，逆转录聚合酶链反应(RTPCR)、ethods:EstablishedarebinantpcDNA3.1(+)/fhitincludingfunctionalregionofhumanfhit,HuH7fhit,to

2、transferintothecellsofhumanhepatocellularcarcinomainvitro.ThemRNAandproteinexpressionofthegeneinthetransfectedcellseasuredbyfloetry.5micereceivedsubcutaneoustransplantationofHuH7fhit,5micereceivedsubcutaneoustransplantationofnormalHuH7andHuH7Cascontrol.Thebodyic

3、eandtumorgroeasured.Results:RTPCRandRNAandfhitproteinafterinfectionorarkedlybyfhit.TheresultsshoorsarisingfromtheHuH7fhitcellsoccurredmuchlaterparedtothosearisingfromtheHuH7andHuH7Ccells.HuH7fhitcellsalsodisplayedsloorvolume.Thetumorcontrolratesanhepatocellul

4、arcarcinomacellsandinducecellapoptosisinvitroandinvivo.［KEYTT)比色法检测转染前、后细胞增殖能力　　1×104细胞(每孔200μL)接种于96孔培养板，每组细胞接种6孔，设3个平行孔，加入MTT(5g/L)液后继续孵育4h，终止培养再加DMSO,酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(波长为570nm)。每隔24h同样以上测定，连续测定6d，观察3组细胞增殖能力变化。　　1.2.6流式细胞仪分析细胞周期及凋亡　　检测前以胰酶消化细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，用预冷的

5、70%乙醇固定，4℃过夜.以PBS洗脱乙醇，并用PBS制备单细胞悬液，碘丙锭(PI)染色后，用流式细胞仪(FCM)分析细胞周期变化及凋亡率。　　1.2.7裸鼠抑制瘤试验　　实验分3组，每组5只裸鼠，分别用于接种转染HuH7、HuH7C和HuH7fhit细胞，用此克隆细胞进行裸鼠背部皮下注射，每只接种细胞数约为1×106个，观察各组试验动物成瘤情况。于接种后每隔1周观察1次肿瘤的体积大小，7周后处死动物，剥离肿瘤，测量肿瘤大小并称瘤重，根据公式V=ab2/2(a为长径，b为短径)计算瘤体积，绘制生长曲线，计算抑瘤率＝［(

6、V对照组V实验组)/V对照组］×100%。　　1.3统计学处理SPSS11.5统计软件进行，采用t检验和方差分析，数据以(±s)表示，P<0.05表示差异有统计学意义。　　2结果　　2.1质粒的鉴定质粒PBluescriptSKfhit送上海生工生物工程公司测序，与GenBank的fhitmRNA序列相符(登陆号:NM_002012),质粒PBluescriptSKfhit经双酶切BamHⅠ和XbaⅠ后，琼脂糖凝胶电泳可见1.0kb和2.7kb的2条DNA条带(图1),质粒pcDNA3.1(+)/fhit经内切酶BamH

7、Ⅰ和XbaⅠ后，琼脂糖凝胶电泳可见1.0kb和5.4kb的2条DNA条带(图1)，说明pcDNA3.1(+)/fhit构建成功。　　2.2质粒转染前后细胞fhitmRNA的表达转染pcDNA3.1(+)/fhit后，HuH7fhit细胞fhitmRNA阳性，为400bp条带，而空载体转染细胞HuH7C和亲本细胞HuH7未见此条带的表达(图2)。　　2.3质粒转染前、后细胞fhit蛋白的表达转染pcDNA3.1(+)/fhit后，HuH7fhit细胞中有17kD的fhit蛋白表达，而空载体转染细胞HuH7C和

8、亲本细胞HuH7未见fhit蛋白表达(图3)。　　2.4噻唑蓝(MTT)比色法检测转染前后细胞增殖能力的变化fhit基因转染细胞HuH7fhit较空载体转染细胞HuH7C和亲本细胞HuH7的生长速度明显减慢，尤其是达到对数生长期后更加明显，差异有统计