脂质体包裹tgf┐α反义脱氧寡核苷酸抑制人大肠癌细胞的增殖论文

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1、脂质体包裹TGF┐α反义脱氧寡核苷酸抑制人大肠癌细胞的增殖论文.freels;transforminggroeAbstract:AIMToinvestigatetheeffectsofTGF-αanti-senseoligodeoxynucleotides（ASODN）onhumanrectalcarci-nomacelllineHR8348.METHODSCationicliposomeandlipofectamineentice.RE┐SULTSProliferationandDNAsynthe

2、sisofHR8348cellstreatedorigenicrateancoloncancercelllineinvitroasplicatethepotentialvalueincolorectalcancergenetherapy.0引言转化生长因子α（TGF-α）在多种肿瘤中的过表达促进了瘤细胞的增殖、分裂，并与肿瘤的恶性表性有关［1］，有报道称大肠癌组织中也存在TGF-α的高表达［2，3］.我们在查明HR8348细胞系存在TGF-α高表达后，用TGF-α反义脱氧寡核苷酸（ASODN）对其进

3、行细胞转染，研究该反义脱氧寡核苷酸对该细胞系细胞生长的抑制作用.1材料和方法1.1材料人大肠癌细胞株HR8348来源于1例男性直肠腺癌患者的手术切除标本，由中国医学科学院肿瘤研究所提供，培养在含100mLL-1小牛血清的RPMI1640（Gibco公司）培养液，37℃，50mLL-1CO2的环境中.1.2合成硫代寡脱氧核苷酸TGF-α反义脱氧寡核苷酸（ASODN）由18个碱基组成，与TGF-αcDNA前3个密码子及其上游部位3个密码子碱基序列互补.反义链序列为5’-GGGGACCATTTTACGG-

4、GC-3’;无关对照寡聚核苷酸（N-ODN）由18个碱基随机组合，序列为5’-GCTAGGATCTGGAGCTCG-3’，经基因库检索不与已有的已知编码序列相互补.以上ODN均用硫代磷酸修饰，由本校生物化学教研室合成.1.3脂质体┐ODN复合物的制备阳离子脂质体LipofectAMINE［4］购自Gibco公司，制备前将ODN稀释于0.1mL无血清无抗生素的RPMI1640中，加入同样方法稀释的脂质体，混匀，室温放置5～10min，即可形成脂质体-ODN复合物并立即用于细胞处理.脂质体与ODN用量参

5、考说明书.1.4细胞处理用无血清无抗生素的RPMI1640稀释HR8348细胞，接种0.8mL细胞（约1.5×106个）于35mm培养皿.将脂质体ODN复合物（0.2mL）加入培养皿，充分混匀，添加4mL含血清RPMI1640继续培养48h，而后收集细胞.1.5ODN对HR8348细胞生长增殖的影响采用MTT法及［3H］-TdR掺入试验.取对数生长期细胞用无血清无抗生素RPMI1640稀释，接种40μL细胞（约1×104个）于96孔培养板，加入脂质体-ODN复合物，充分混合，培养5h后，添加200μ

6、L含血清RPMI1640继续培养48h.而后吸弃上清，以RPMI1640清洗两遍，加入RPMI1640液200μL，MTT（5gL-1）20μL，37℃培养4h后吸弃上清液，每孔加二甲基亚砜（DMSO）200μL，振荡10min，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测其吸光度，每组复设3孔，取均值.设空白对照、阴性对照各1组.另1个96孔板中同上加入细胞及脂质体-ODN复合物，培养5h后添加200μL含血清RPMI1640继续培养24h，向培养液中加入［3H］-TdR，培养24h后按文献［5］进行测定

7、.1.6脂质体为载体对ASODN作用效率的影响用3’末端标记法将［α-35S］标记到ASODN上.将细胞（2×105mL-1）铺种于24孔培养板，加入脂质体包装与未包装的［α-35S］ASODN，终浓度为10μmolL-1，置37℃50mLL-1CO2孵箱中培养.分别于24，48和72h取出细胞，以PBS洗涤，至上清液放射计数为0.测定细胞中［α-35S］的放射活性.1.7细胞周期动力学分析将处理细胞经胰蛋白酶消化后，制成1×104L-1细胞悬液，碘化丙啶（PI）染色，FACScan流式细胞仪测定.

8、1.8裸鼠致瘤能力试验裸鼠11只分成试验组、空白组、阴性对照组，分别为4，3和4只，每只于皮下注射1×107细胞.2结果2.1ODN对HR8348细胞DNA合成及生长增殖的抑制TGF-α反义ODN能抑制HR8348细胞的DNA合成及生长增殖.与空白对照组相比，肿瘤细胞生长增殖的抑制率为71%，［3H］-TdR掺入实验的抑制率为73%.而经无关对照ODN处理的阴性对照组对HR8348细胞的生长增殖以及DNA合成无显著抑制.2.2HR8348细胞对［α┐35S］ASODN