六月青含药血清对hepg2.2.15细胞　hbv cccdna的抑制作用论文

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1、六月青含药血清对HepG2.2.15细胞　HBVcccDNA的抑制作用论文黄权芳，林兴，黄仁彬，张士军【摘要】目的观察六月青(Liuyueqing，LYQ)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法采用血清药理学方法，在HBV的体外细胞培养系统中(2.2.15细胞)进行LYQ抗HBVcccDNA作用观察。结果LYQ含药血清在HepG2.2.15细胞培养中可有效地抑制细胞HBVcccDNA的复制，其作用呈明显的量效和时效反应关系。结论LYQ在体外有明显的抑制乙肝病毒的作用。【关键词】六月青;乙型肝炎病毒;HepG2.2.15细胞;HBVcccDNAAbstract：ObjectiveT

2、ostudytheanti-HBVactivityofLiuyueqing(LYQ)invitro.MethodsTheHBVinvitrocellculturesystem(HepG2.2.15cell)iningtheanti-HBVactivityofLYQ-pharmacology.ResultsTheserumcontainingLYQcoulddecreasetheHBVDNAlevelinHepG2.2.15cells,.freele-dependent.ConclusionLYQcaninhibitHBVDNAinvitrosignificantly.Keyysaf

3、finis(Griff)BremekhuStrobilanthesaffinis(Griff)Y.C.Tang的干燥地上部分1。本课题组前期研究发现.freela公司，CatNo.228527-72);QIAampDNAMiniKit试剂盒(Qiagen公司，No.127141405);HBVDNA荧光定量PCR试剂盒(深圳匹基生物工程股份有限公司，批号：20070613);SYBRGreenPCRKit(Qiagen公司，No.127144035)。1.5仪器iCyclerFQ实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司);CO2孵箱(美国ThermoForma公司，Model3

4、11)。2方法2.1LYQ含药血清的制备3月龄组：3.3g·kg·d-1;⑤LYQL组：1.7g·kg·d-1。各组动物在同样条件下饲养，均以2次/d，早晚各1次空腹灌胃，连续给药7d。于末次灌胃(灌胃前禁食不禁水12h)后2h，乙醚吸入麻醉，腹主动脉抽血，低速离心分离血清，并将每组动物的血清混合。经56℃30min灭活处理，经0.45μm的微孔滤膜，再经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，置-20℃冰箱保存备用。2.2引物合成P1：ACCGTGTGCACTTCGCTFC，P2：AGTAGGACATGAACAAGAGATGATTAGG;另一对引物，其正义引物与反义引物均位于负链缺口下游

5、双链区域，可同时扩增：rcDNA和cccDNA。P3：GCCTCCAAGCTGTGCCTFG，P4：TCTGCGACGCGGCGATrGAG。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。2.3细胞的培养取HepG2.2.15细胞1瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×104cell·ml-1，加入24孔细胞培养板，每孔900μl，置CO2孵箱(37℃，5%CO2)中培养24h后，分别加入各组含药血清100μl，每个浓度3个复孔。以等量的完全培养液为空白对照。连续培养72h后，分别吸出上清液于1.5ml灭菌Eppendor管中，-20℃保存，统一待检。再次加入上述含药

6、血清的培养液继续培养72h后，分别吸出上清液于1.5ml灭菌Eppendorf管中，-20℃保存，统一待检。2.4HBVccDNA的提取取细胞样本，离心去上清液，用QIAampDNAMiniKit试剂盒抽提cccDNA，按试剂盒说明书操作。cccDNA产物溶于50mlpH8.0的TE溶液。测定提取物吸光度A260nm和A280nm，根据A260和A280的比值计算样品的DNA纯度。2.5酶切cccDNA取cccDNA提取物10μl，用绿豆核酸酶酶切。37℃温育25min，用2μl100mmol·L-1的EDTA(pH7.4)灭活绿豆核酸酶。2.6PCR扩增4取5μl样品，加入PCR

7、试剂和引物，各反应管放入FQ-PCR仪，按以下条件进行扩增：94℃预变性1min，95℃变性5s，60℃退火、延伸20s。共反应42个循环。扩增过程及荧光信号检查、数据的储存和分析均由仪器及其自带的软件自动完成。2.7统计学处理采用SPSS10.0统计软件分析数据，组间比较采用方差分析。3结果与空白对照组比较，LYQ中、高剂量含药血清作用72，144h后，HepG2.2.15细胞上清液中HBVcccDNA的拷贝数明显降低(P0.05或P0.01)，提示对HBVcccD