六月青总皂苷对hepg2.2.15细胞hbv复制的抑制作用

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1、六月青总皂苷对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用【关键词】六月青总皂苷；乙型肝炎病毒；HepG2.2.15细胞　　Abstract：ObjectiveTostudyanti-HBVactivityoftheterpenoidsofLiuyueqing(TLYQ)invitro.MethodsTheHBVinvitrocellculturesystem(HepG2.2.15cell)iningtheanti-HBVactivityofTLYQ-pharmacology.ResultsTh

2、eserumcontainingTLYQcoulddecreasetheHBVDNAlevelinHepG2.2.15cell,anditsinhibitoryeffectse-dependent.ConclusionTLYQcaninhibitHBVDNAinvitrosignificantly,anditmaybeoneofthemainactiveponentsofLiuyueqing.　　Keyysaffinis(Griff)Bremekhu［Strobilanthesaffinis(G

3、riff)Y.C.Tang］的干燥地上部分［1］。六月青是复方六月雪（CLYX）主要成分之一，本课题组前期研究表明，CLYX具有明显地抗HBV［2，3］和改善急性化学性肝损伤的作用［4］。本研究以转染有HBVDNA的HepG2.2.15为模型，采用中药血清药理学方法，观察TLYQ对HBV复制的影响，并初步探讨其作用机制，为筛选出六月青中抗HBV主要活性部位提供实验依据。　　1材料与仪器　　1.1药物六月青总皂苷，由广西医科大学药理学教研室和广西医学科学实验中心自行提取。　　1.2动物I1640培

4、养基：美国Gibco公司，Cat№21202-016；胎牛血清：美国Gibco公司，Cat№21607-042；G418：美国Sigma公司，Cat№228527-72；HBVDNA荧光定量PCR试剂盒：深圳匹基生物工程股份有限公司，批号：20070613。　　1.5仪器iCyclerFQ实时荧光定量PCR仪：美国Bio-Rad公司；CO2孵箱：美国Thermo　Forma公司，Model311。　　2方法　　2.1六月青总皂苷的制备六月青粗粉1.0kg，加10倍量80%乙醇回流提取3次，1.5

5、h/次，减压回收乙醇至无醇味，分别用石油醚、氯仿、醋酸乙酯萃取，弃去有机溶剂萃取液，最后再用水饱和正丁醇萃取，取正丁醇萃取液减压浓缩至干，得到41.28g浸膏，上处理好的AB-8型大孔树脂柱（40mm×800mm），分别用6BV的30%乙醇和50%乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压回收乙醇，60℃的减压恒温干燥箱中干燥得4.28g淡黄色化合物，经常规化学定性试验证实为皂苷类，利用香草醛-硫酸分光光度法测定总皂苷含量［5］，纯度为85.8%。　　2.2TLYQ含药血清的制备3月龄组：14.1×10-3g

6、·kg-1·d-1（相当于生药3.3g·kg-1·d-1）；⑤TLYQL组：7.1×10-3g·kg-1·d-1（相当于生药1.7g·kg-1·d-1）。各组动物在同样条件下饲养，均以2次/d，早晚各1次空腹灌胃，连续给药7d。于末次灌胃（灌胃前禁食不禁水12h）后2h，乙醚吸入麻醉，腹主动脉抽血，低速离心分离血清，并将每组动物的血清混合。经56℃30min灭活处理，经0.45μm的微孔滤膜，再经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，置-20℃冰箱保存备用。　　2.3荧光定量PCR（FQ-PCR）法检

7、测HBVDNA取HepG2.2.15细胞1瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×104cell·ml-1，加入24孔细胞培养板，每孔900μl，置CO2孵箱（37℃，5%CO2）中培养24h后，分别加入各组含药血清100μl，每个浓度3个复孔。以等量的完全培养液为空白对照。连续培养72h后，分别吸出上清液于1.5ml灭菌Eppendor管中，-20℃保存，统一待检。再次加入上述含药血清的培养液继续培养72h后，分别吸出上清液于1.5ml灭菌Eppendorf管中，-20℃保存

8、，统一待检。按试剂盒方法提取样品HBVDNA。HBVDNA定量标准品由深圳匹某公司直接提供。各反应管放入FQ-PCR仪，按以下条件进行扩增：94℃预变性1min，95℃变性5s，60℃退火、延伸20s。共反应42个循环。扩增过程及荧光信号检查、数据的储存和分析均由仪器及其自带的软件自动完成。　　2.4统计学处理采用SPSS10.0统计软件分析数据，组间比较采用方差分析，各均数两两比较。　　4讨论　　复方六月雪（CLYX）是通过长时期的民间临床观察而拟定的治疗急慢性乙型肝炎和肝硬化的验方，主要由广