扶正解毒汤含药血清对镍转化细胞增殖抑制作用研究

《扶正解毒汤含药血清对镍转化细胞增殖抑制作用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、http://www.paper.edu.cn扶正解毒汤含药血清对1镍转化细胞增殖抑制作用研究吕晓云，蒲晓丽，朱玉真，赵健雄，孙应彪兰州大学中西医结合研究所，兰州（730000）E-mail：lvxy@lzu.edu.cn摘要：目的通过细胞培养方法，研究灌服中药扶正解毒汤（FJD）后兔血清对镍转化细胞（Nt16HBE）增殖的抑制作用。方法将FJD血清作用于Nt16HBE细胞7d，分别以四甲基固氮唑盐（MTT）法、流式细胞仪（FCM）及TRAP-PCR-ELISA法检测FJD血清对镍转化细胞生长的抑制情况及其对核转录

2、－kB（NF-κB）、端粒酶活性变化的影响。结果10％体积分数的高、中、低剂量FJD血清对Nt16HBE细胞生长以及NF-κB、端粒酶活性均有较强的抑制作用，且存在剂量－效应和时间－效应关系(P<0.05~0.01)。结论FJD血清可显著抑制镍转化细胞增殖，其机制与下调NF-kB、端粒酶表达有关。提示FJD具有一定的体外拮抗镍致癌效应。关键词：正解毒汤；含药血清；镍；细胞增殖；核转录因子-κB；端粒酶[1]镍化合物为人类Ⅰ类确证致癌物。多年来，国内外运用各种实验方法进行了大量有关镍致癌的动物实验及职业病临床研究，取

3、得了重要的进展。其中，体外镍暴露诱导细胞恶性转化作为敏感的遗传终点之一，具有极高的可信度。许多实验室已建立了多种镍化合物诱导啮齿类及浦乳类细胞恶性转化模型。同时，人们也在积极寻求有效的镍毒性包括镍致癌的干预手段。近十六年来，本课题组运用扶正解毒汤（FJD）进行了系统的镍毒性干预的体内动[2，3]物实验及临床研究，证实了该复方的有效性。本研究首次以经硫酸镍（NiSO4）诱导恶[4]性转化的人支气管上皮（16HBE）细胞（简称Nt16HBE）为研究目标，从体外途径观察FJD对镍转化细胞增殖的抑制作用并探讨其作用机制，以

4、期为该复方拮抗镍致癌性提供新的理论依据。1.材料与方法1.1材料1.1.1细胞及动物16HBE细胞及Nt16HBE细胞由广州医学院化学致癌研究所建系并惠赠。纯种青紫兰兔16只，雄性，体重（2.1±0.3）kg，由中国兰州生物制品研究所提供（合格证号：14－004），常规饲养。1.1.2中药扶正解毒汤（FJD）由红芪、茯苓、丹参、枸杞、当归、莪术、连翘按4:4:3:3:2:2:2组方，生药由甘肃省药材公司提供，经鉴定全部为道地药材。上药混合，加三蒸水煎煮，制0备成含生药4g/ml药液，4C保存备用。1.1.3主要试剂

5、及设备MEM培养基、胰蛋白酶（GIBCO公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料公司）；MTT（Sigma公司）；NF-κBP65（SantaCruz公司）、二抗购自武汉博士德公司；端粒酶活性检测试剂盒（武汉博士德公司）；CO2恒温培养箱（MCO-15AC型，日本SANYO），相差倒置显微镜（日本OLYMPUS），冷冻干燥机（FD-1型，北京博医康技术公司）。流式细胞仪（EPICSELITE型，美国Coulter公司）。酶标仪（HTⅢ型，奥地利Anthos公司）1本课题得到教育部博士点专项科研基金（NO.20050

6、730031）的资助。-1-http://www.paper.edu.cn1.2方法-1-11.2.1FJD血清冻干粉制备FJD高、中、低剂量组分别以FJD12、6和3g﹒kg﹒d灌胃（给药中剂量＝临床常用量×动物等效面积系数×培养基内血清稀释度，高、低剂量分别为中剂量乘以及除以2），空白对照组予以生理盐水。各组每日分2次等体积灌胃（灌胃前禁食，自由取水），共3d，于末次灌胃后2h心脏采血，室温下静置4h，2400r/min离心10min，分00离血清，0.22μm微孔滤膜过滤，56C水浴灭活后，在－70C条件下，

7、以超低温冷冻干燥机制成不同剂量的含药血清冻干粉，实验时均以不含小牛血清的MEM培养液溶解，按10％体积分数加入反应体系。1.2.2细胞培养16HBE细胞及Nt16HBE细胞同步复苏后，用含10%小牛血清，青霉素、链0霉素各10万U/L的MEM培养基于37C，5％CO2饱和湿度的环境中培养，待细胞生长至一定密度（80－90％融合）后按1：3或1：4传代。1.2.3细胞增殖抑制试验消化单层培养的Nt16HBE细胞，制备单细胞悬液，计数并调整细4胞密度。以每孔1×10个细胞接种于96孔培养板（每孔培养液200μl）。每孔

8、细胞中分别加入高、中、低不同剂量FJD血清及空白血清，终浓度均为10％。每组设6个复孔。另设0不加药物的对照组及正常16HBE对照组。于37C，5％CO2培养箱中继续培养。分别于给药后第1，3，5，7d以相差倒置显微镜观察各组活细胞形态变化，并取细胞进行MTT比色试验：每孔加入MTT溶液（5g/L）20μl继续孵育4h，终止培养后吸弃上清，加入150μl二甲