六月青总皂苷对hepg2.2.15细胞hbv复制的抑制作用论文

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1、六月青总皂苷对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用论文林兴，黄权芳，张士军，刘曦，黄仁彬【摘要】目的观察六月青总皂苷（theterpenoidsofLiuyueqing，TLYQ）体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用。方法采用血清药理学方法，在HBV的体外细胞培养系统中（2.2.15细胞）进行TLYQ抗HBV作用观察。结果TLYQ含药血清在HepG2.2.15细胞培养中可有效地抑制细胞HBVDNA的复制，其作用呈明显的量效和时效反应关系。结论TLYQ在体外能明显抑制HBV.freel(HepG2.2.15cell)iningtheanti-HBVactivityof

2、TLYQ-pharmacology.ResultsTheserumcontainingTLYQcoulddecreasetheHBVDNAlevelinHepG2.2.15cell,.freele-dependent.ConclusionTLYQcaninhibitHBVDNAinvitrosignificantly,anditmaybeoneofthemainactiveponentsofLiuyueqing.Keyysaffinis(Griff)Bremekhu［Strobilanthesaffinis(Griff)Y.C.Tang］的干燥地上部分［1］。六月青是复方

3、六月雪（CLYX）主要成分之一，本课题组前期研究表明，CLYX具有明显地抗HBV［2，3］和改善急性化学性肝损伤的作用［4］。本研究以转染有HBVDNA的HepG2.2.15为模型，采用中药血清药理学方法，观察TLYQ对HBV复制的影响，并初步探讨其作用机制，为筛选出六月青中抗HBV主要活性部位提供实验依据。1材料与仪器1.1药物六月青总皂苷，由广西医科大学药理学教研室和广西医学科学实验中心自行提取。1.2动物I1640培养基：美国Gibco公司，Cat№21202-016；胎牛血清：美国Gibco公司，Cat№21607-042；G418：美国Sigma公司，Cat№2

4、28527-72；HBVDNA荧光定量PCR试剂盒：深圳匹基生物工程股份有限公司，批号：20070613。1.5仪器iCyclerFQ实时荧光定量PCR仪：美国Bio-Rad公司；CO2孵箱：美国ThermoForma公司，Model311。2方法2.1六月青总皂苷的制备六月青粗粉1.0kg，加10倍量80%乙醇回流提取3次，1.5h/次，减压回收乙醇至无醇味，分别用石油醚、氯仿、醋酸乙酯萃取，弃去有机溶剂萃取液，最后再用水饱和正丁醇萃取，取正丁醇萃取液减压浓缩至干，得到41.28g浸膏，上处理好的AB-8型大孔树脂柱（40mm×800mm），分别用6BV的30%乙醇和5

5、0%乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压回收乙醇，60℃的减压恒温干燥箱中干燥得4.28g淡黄色化合物，经常规化学定性试验证实为皂苷类，利用香草醛-硫酸分光光度法测定总皂苷含量［5］，纯度为85.8%。2.2TLYQ含药血清的制备3月龄组：14.1×10-3g·kg-1·d-1（相当于生药3.3g·kg-1·d-1）；⑤TLYQL组：7.1×10-3g·kg-1·d-1（相当于生药1.7g·kg-1·d-1）。各组动物在同样条件下饲养，均以2次/d，早晚各1次空腹灌胃，连续给药7d。于末次灌胃（灌胃前禁食不禁水12h）后2h，乙醚吸入麻醉，腹主动脉抽血，低速离心分离血清，并将每组

6、动物的血清混合。经56℃30min灭活处理，经0.45μm的微孔滤膜，再经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，置-20℃冰箱保存备用。2.3荧光定量PCR（FQ-PCR）法检测HBVDNA取HepG2.2.15细胞1瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×104cell·ml-1，加入24孔细胞培养板，每孔900μl，置CO2孵箱（37℃，5%CO2）中培养24h后，分别加入各组含药血清100μl，每个浓度3个复孔。以等量的完全培养液为空白对照。连续培养72h后，分别吸出上清液于1.5ml灭菌Eppendor管中，-20℃保存，统一待检。再次加入上述含药血清

7、的培养液继续培养72h后，分别吸出上清液于1.5ml灭菌Eppendorf管中，-20℃保存，统一待检。按试剂盒方法提取样品HBVDNA。HBVDNA定量标准品由深圳匹某公司直接提供。各反应管放入FQ-PCR仪，按以下条件进行扩增：94℃预变性1min，95℃变性5s，60℃退火、延伸20s。共反应42个循环。扩增过程及荧光信号检查、数据的储存和分析均由仪器及其自带的软件自动完成。2.4统计学处理采用SPSS10.0统计软件分析数据，组间比较采用方差分析，各均数两两比较。3结果与空白对照组比较，TLYQ中、高剂量含药血清作用7