化浊行血汤含药血清血管内皮保护作用及其体内给药时效差异的研究论文

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1、化浊行血汤含药血清血管内皮保护作用及其体内给药时效差异的研究论文.freelin后取血所得药物血清药理效应最佳。结论化浊行血汤含药血清具有保护缺氧内皮细胞的作用.freelaScientific公司）；倒置相差显微镜（美国AOSientificInstrument；酶标仪）；EL340I全自动酶标仪（美国Biotok公司产品）。2方法2.1药物的配制和含药血清的制备化浊行血汤由荷叶、焦山楂、决明子、赤芍、酒大黄、路路通、虎杖、何首乌，制水蛭粉组成（全部药材来源于山东中医药大学附属医院），为水煎醇沉工艺制作浸膏，4℃贮存备用。

2、取SD大鼠按8.25g/kg灌服化浊行血汤。中药A组大鼠按照每日灌胃两次连续3d，中药B组大鼠按照灌胃1次/d，连续5d，空白组灌服等量生理盐水，末次给药前禁食12h，给药后30，60，90，150min腹主动脉取血，分离血清并灭活、过滤除菌，置－20℃保存备用。2.2内皮细胞体外缺血、缺氧模型的建立和实验分组选择生长良好的内皮细胞，以5×104/ml密度接种于96孔板，培养24h后，分为正常对照组、模型组及药物（缺氧）各剂量组进行缺血、缺氧造模及干预。①正常组：换1640培养基（164090%，正常大鼠血清10%），并始终

3、在正常条件下培养。②模型组：以2006年叶武等［1］报告的方法稍加改进。缺氧时先将缺氧罐（由干燥皿改装）提前10min充入氮气（流速4.5L／min），以保证缺氧罐内气体的纯度，罐周边封凡士林密闭，然后置于37℃生化培养箱中，备用。将培养板中内皮细胞换缺氧无血清1640培养基（用前预先向培养基通入氮气3min）；将其放入缺氧罐内。缺氧6h后，将培养液换为含10％正常大鼠血清的1640培养液，置于培养箱中（空气+5%CO2）继续培养18h，然后进行检测。③中药各剂量组：造模同模型组，缺氧6h后，将培养液换成含10％SD大鼠药物

4、血清的1640培养液，置于培养箱中（空气+5%CO2）继续培养18h，然后进行检测。2.3四氮唑蓝(MTT)检测各组内皮细胞两次，各加入1640100μl，MTT15μl，继续置培养箱中孵育4h。吸弃孔内液体，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100μl，终止反应。振荡器振荡10min，全自动酶标仪490nm波长，空白孔调零，测定各孔吸光度（OD）值。2.4统计学处理使用SPSS10.0软件进行统计。组内差异采用t检验，组间差异采用多因素方差分析，F检验(Avon)。3结果3.1各组内皮细胞形态特征变化镜下观察正常组内皮细胞展开

5、贴壁，形态无明显改变。体外模拟缺氧6h后模型组内皮细胞回缩，间隙变大，变圆细胞增多，常规培养18h后大量内皮细胞变圆并呈团漂浮，折光性增强。中剂量中药各组镜下观察缺氧并经含药血清干预后也可见细胞回缩，部分细胞变圆并漂浮；但各组仍见贴壁的内皮细胞数量明显多于模型组，漂浮变圆细胞明显少于模型组。3.2各组内皮细胞缺血缺氧后细胞活力的比较（MTT实验）结果见表1。表110％化浊行血汤含药血清对缺氧内皮细胞MTT比色实验的影响（略）4讨论4.1化浊行血汤含药血清的对缺氧复氧内皮细胞的保护作用王新陆教授根据多年的临床经验，以“血浊”立

6、论，创立清化血浊法治疗中风，并据此组方化浊行血汤。化浊行血汤由荷叶、焦山楂、决明子、赤芍、制水蛭、酒军、路路通、虎杖、何首乌组成。动物实验研究表明，化浊行血汤能明显改善MCAO大鼠缺血再灌注后的神经功能损伤、减小缺血再灌注脑损伤的体积，该治疗作用与其对脑血管内皮细胞、神经细胞的保护作用有关。本实验建立血管内皮细胞缺血再灌注模型，利用化浊行血汤含药血清进行干预，以MTT评价内皮细胞缺氧损伤变化。MTT在活细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶作用下还原成一种蓝紫色结晶并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，在一定细胞数范围内，MTT结晶物

7、形成的量与活细胞数量成正比。实验研究证明缺氧复氧后内皮细胞活力明显下降并伴有显著地形态学异常，而化浊行血汤含药血清能显著提高缺氧复氧后内皮细胞的活力且形态学改变较小。提示该方具有明显的血管内皮细胞保护作用。4.2化浊行血汤含药血清药效与动物体内给药有一定的时效关系中药血清药理学研究表明，含药血清的时效主要与动物的给药时间和取血时间有关。由于不同中药复方成分很大差别，给药后的峰值出现的时间亦有较大差别。血清中确切的药效成分并不清楚时，应利用药效为指标行“时效关系”研究，以评判最佳给药时间和取血时间。严格地说，应该根据药物半衰期

8、给药，连续5～7个半衰期达到稳态血药浓度，但由于中药及其复方成分复杂，半衰期很难测定，我们按照化浊行血汤为半衰期12h设定每日灌胃两次连续3d给药方案A，按照化浊行血汤为半衰期12h设定每日灌胃1次连续6d给药方案B，结果表明两种方案获得含药血清无明显差别。如果对药物血清时效关系进行研究，