诃子提取物及含药血清对大鼠肝细胞损伤保护作用的研究论文

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1、诃子提取物及含药血清对大鼠肝细胞损伤保护作用的研究论文李刚，张述禹，王玉华，关海滨，彭云寿【摘要】目的观察诃子提取物以及含药血清对CCl4引起大鼠肝细胞损伤保护作用，以及保肝作用机理的初步探讨。方法采用Ⅳ型胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞进行原代培养，体外采用CCl4(20mmol/L)诱导肝细胞损伤，采用光镜观察、MTT法以及MDA检测.freelg/L)和0.9g/kg所制备的含药血清能够改善CCl4所引起的细胞形态变化，显著提高细胞活力，能够有效抑制CCl4引起的肝细胞脂质过氧化作用，并提高脂质过氧化酶SOD和GSH-Px的活性。结论诃子提取物及其含药

2、血清具有保肝作用，这种作用与提高抗氧化酶的活性有关。【关键词】诃子;肝损伤;抗氧化诃子为常用的中药之一，收载于《中国药典》1。诃子是使君子科植物诃子TerminaliachebulaRetz或绒毛诃子TchebulmRetzvartomentellaKurt的干燥成熟果实，生产于印度及斯里兰卡，我国云南亦有生产。诃子具有涩肠止泻敛肺，降火利咽的功效。诃子的主成分为诃子酸(chebulinicacid)、诃黎勒酸(chebulagicacid)、1,3,6-三没食子酰葡萄糖等2。近期报道有三帖类、多元酚酸类、脂肪族化合物以及氨基酸、矿物质等成分3。对诃子

3、药理作用研究发现诃子具有抗菌、强心、抗氧化以及解痉等作用4，另有文献报道含有诃子的复方具有明显的抗肿瘤及抗艾滋病毒活性5，6。关于诃子保肝作用的研究，本研究室在先前的动物实验中已有报道7。本文采用体外分离大鼠肝细胞进行肝细胞原代培养，用CCl4诱导肝细胞损伤模型，观察诃子提取物(extractofTerminaliachebulaRetz，ET)对肝细胞损伤保护作用以及作用机理的初步研究，并为进一步发现活性组分确定体外筛选技术。1材料与仪器1.1药物诃子购自内蒙古凯蒙大药房，经内蒙古医学院药学院植化教研室庞秀生教授鉴定为使君子科植物诃子Terminal

4、iachebulaRetz的干燥成熟果实。1.2试剂MTT、Ⅳ型胶原酶购自SIGMA公司，RPMI-1640购自GIBCO公司，CCl4天津市化学试剂三厂生产，GOT购自中生北控生物科技股份有限公司，MDA、SOD、GSH-Px试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其它试剂均为市售分析纯。1.3动物清洁级ENARINI公司)，721型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)，高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机厂)，MODEL680型酶联免疫检测仪(Bio-BadLABORATIES,INC)。2方法2.1诃子提取物的制备100g鞣质经3次丙酮提取后(55℃加热回流

5、提取)，弃去残渣，收集合并3次滤液，加入等体积的乙醚除杂质，弃去醚层，收集水层，用等体积的醋酸乙酯萃取5~6次，收集醋酸乙酯层，回收醋酸乙酯，在55℃水浴蒸干得黄色粉末，研磨备用。2.2诃子含药血清制备大鼠实验前禁食12h，大鼠20只分为5组，雌雄各半，实验前禁食12h。空白组每天灌服蒸馏水(2m1/kg)、诃子含药血清4个不同给药组(剂量分别为0.06，0.3，0.6，0.9g/kg),各组每天给药2次，连续灌服3d并在最后1次灌胃后2h,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，行腹主动脉无菌采血凝固后，低温离心分离血清，将各组4只大鼠血清混合，置-20℃冰箱保存备

6、用8。2.3大鼠肝实质细胞原代培养取SO助溶，继续培养1h。2.5MTT法检测诃子提取物及含药血清对CCl4诱导肝细胞损伤保护作用取贴壁生长的肝细胞，设空白组、CCl4模型组、诃子提取均设置4个剂量组(0.4，0.6，0.8，1mg/L);另外设置4个诃子提取物含药血清组，使血清终体积为20%，每组设8个复孔。各组在加入CCl4培养1h后，分别加入待测药物继续培养6h，在光镜下进行细胞形态学检查，同时每孔加MTT10μl，孵育4h，弃去上清，每孔加DMSO150μl，振摇10min，在570nm处用酶标仪检测吸光度。2.6GOT、MDA、SOD和GSH

7、-Px的检测收集各孔中的细胞，参照试剂盒说明书检测GOT、SOD和GSH-Px以及MDA含量。3结果3.1光镜下观察诃子提取物对于CCl4所诱导损失的保护作用在光镜下观察发现CCl4损伤1h后，肝细胞形态发生显著的变化，镜下可以看到细胞的膜结构被破坏，大量肿胀坏死细胞。而诃子提取物以及含药血清组中对于这种形态改变具有显著的改善作用。3.2诃子提取物以及含药血清对CCl4诱导肝细胞损伤后细胞活力的影响诃子提取各浓度组(0.4，0.6，0.8，1mg/L)分别作用于肝细胞损伤6h后，由MTT结果可以看出，诃子提取物0.6，0.8，1mg/L组中与CCl4模

8、型组比较具有明显的保护作用(P0.01)，而且这种保护作用具有一定的量效关系。见表1将不同剂量