第六讲 aflp技术及其在果树学上的应用

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1、第六讲扩增片段长度多态性（AFLP）技术及其在果树学上的应用12（一）AFLP技术的发展及其原理1．1限制性内切酶1．2模板1．3引物设计1．4PCR反应（二）AFLP技术方法及其特点2．1AFLP的方法2．2AFLP技术的关键2．3AFLP的技术特点及评价（三）影响AFLP技术试验成功的关键因素3．1限制性核酸内切酶的选择和组合3．2接头设计3．3引物设计3．4DNA模板质量和浓度要求3．5PCR产物检测（四）AFLP技术在果树上的应用4．1种质资源遗传多样性及起源与进化研究4．2果树品种鉴别4．3体细胞无性系变异的监测4．4分子遗传图谱的构建4．5目标基因

2、的定位和克隆（五）AFLP技术存在的问题121212分子标记发展至今，可以划分为三个阶段，RFLP是第一代分子标记，该技术以电泳技术和分子杂交技术为核心，结果稳定可靠，重复性好，适应于建立遗传图谱，但它对DNA检出的灵敏度不高，不适应于目前人们对DNA分析精度越来越高的要求；第二代分子标记是RAPD，以电泳技术和PCR技术为核心，该技术简便易行，灵敏度高，缺点是结果的重复性差，稳定性难以保证，在不同实验条件下、设备及操作的情况下得到的实验结果差异很大；AFLP是第三代分子标记，是近年来发展起来的很具生命力的分子生物学技术，本技术结合了RFLP和PCR技术的特点

3、，具有RFLP的稳定性和PCR技术的高效性。利用这一方法，在不需要预先知道DNA序列信息的情况下就可以同时进行多数DNA酶切片的PCR扩增。（一）AFLP技术的发展及其原理AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,扩增片段长度多态性)是1993年由荷兰科学家M.Zabeau和P.Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法，该技术于1993获得欧洲专利局专利（ZABEAUM，1993），其专利权归属荷兰Keygene公司。但很快被人们知道并迅速传播开来，因此M.Zabeau和P.Vos不得不正式以论文形式发表出来（P.V

4、os，1995）。AFLP的原理是基于对植物基因组总DNA双酶切经PCR扩增后的限制片段进行选择。具体是植物基因组DNA经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，将特定双链接头(adapter)连接在这些DNA片段的两端，形成一个带接头的特异片段，作为DNA扩增的模板。接头序列以及与其相连的限制位点作为随后进行的限制片段扩增的引物结合位点。PCR引物3’末端含有选择核苷酸，选择核苷酸延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择核苷酸配对的限制性酶切片段被扩增。扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。AFLP采用EcoRI和MseI识别

5、序列分别为6个碱基(GAATTC)和4个碱基(AATT)。其人工接头和相应引物设计示意如下EcoRIadapter5’———CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA———————5’Mseladapter5’—————GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT——————5’COREENZEXT12EcoRIprimer5’——————GACTGCGTACCAATTCNNN——3’Mselprimer5’——————GATGAGTCCTGAGTAANNN——3’1．1限制性内切酶AFLP采用稀有切点和多切点限制性内切酶

6、搭配作用，使用多切酶可控制限制性片段的长度，而使用稀有切点酶，则可在一定程度上减少扩增片段的数量。双酶切产生的DNA片段一般小于500bp，在AFLP反应中能够被优先扩增，而且扩增产物能够在凝胶中很好的分离开来，便于多态性的检出。两种酶同时对基因组DNA进行消化，会产生三种限制性片段。另外，AFLP采用的两个引物分别与限制性片段的稀有切点末端和多切点酶末端对应，而实际反应中这两种引物中只有一个（通常是稀有切点酶引物）被标记，这样两种限制性内切酶的结合使用就保证了双链PCR产物中只有一条链被标记，从而避免了组成双链PCR产物的两条链因迁移率不同而引起凝胶中双重线

7、的出现。则可因不同生物基因组特征而异。1．2模板AFLP扩增模板序列由双酶切限制性片段和接头序列组成，AFLP的限制性内切酶接头为带有粘性末端的双链DNA序列，这些序列有两部分组成：核心序列（coresequence,CORE）和内切酶特异序列（enzymespecificsequence,ENZ）。AFLP接头大致可以归为两类：一类为稀有切点酶接头，另一类为多切点酶接头。这些接头除粘性末端之一分别与不同的限制性片段末端对应外，其余部分则分别与EcoRⅠ-adapter和MseⅠ-adapter相同。AFLP接头的设计还要遵循这样的原则：（1）具有合适的G.C

8、.含量，限制性片段与对应的接头连接后要