组织型纤溶酶原激活物基因疗法防治血管吻合口血栓栓塞论文

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1、组织型纤溶酶原激活物基因疗法防治血管吻合口血栓栓塞论文.freelosis;thrombo-embolismAbstract:AIMTodevelopaneoticsitesfromthrombo-embolismandtostudytheeffectofgenetherapyinogenactivator（t-PA）geneontheformationofthrombo-embolismofvas-cularanastomoticsites.METHODS1:Rebinantplas-midpAdCMVt-PAlydividedintocontrolandtrea

2、tmentgroups.11-0nylonemedicalsutureratcarotidarteryendtoendanastomoses.Inthetreatmentgroup，AdCMVt-PAsolutionoticsiteedentgroup，butbandcouldnotbefoundinthecontrolgroup.Thet-PAac-tivitycouldbedetectedpostoperationonthe2nd，3rd，5th，7thand14thdayinthetreatment，butcouldnotbedetectedinthecont

3、rolgroup.CONCLUSIONt-PAgenecanproducet-PAhavingbiologicalactivityatanastomoticsites，possiblypreventingtheformationofthrombo-embolismeffectivelyanddevelopingtheanastomoticpatency.0引言近年来，随着血管吻合技术的提高及显微外科器械的完善，微小血管吻合的通畅率不断提高，但不能达到百分之百，吻合口局部血栓形成仍是通畅率低的主要原因［1］.临床常用抗凝药物来防治，但效果不理想［2］，所以有必要寻找一

4、种局部抗凝法来提高通畅率.我们采用吻合口注射含抗凝血基因的真核表达载体AdCMVt-PA溶液，以探讨局部基因疗法对吻合口血栓栓塞的预防作用.1材料和方法1.1试剂、质粒及实验对象RT-PCR试剂盒购自华美公司;t-PA发色底物法检测试剂盒购自上海广慈医学高科技公司;质粒pAdCMVt-PA本实验室构建;pJM17质粒和293细胞为本实验室保存;EM+100mlL-1小牛血清、青霉素100mgL-1和链霉素100mgL-1，37℃，50mlL-1CO2中培养.1.2重组腺病毒的繁殖、纯化和滴度测定［3，4］提取质粒pAdCMVt-PA及pJM17DNA，将两者用磷酸钙

5、沉淀法共转移至含有腺病毒E1区的293细胞中进行同源重组，得到腺病毒颗粒的粗提液.用此粗提液再感染293细胞，24h后收集细胞作PCR，确定阳性表达克隆.再在293细胞中扩增腺病毒，用氯化铯密度梯度离心法制备纯化的重组腺病毒，并进行透析处理.用噬斑分析法测定腺病毒滴度.分装小管，-80℃保存备用.1.3重组腺病毒在吻合口局部治疗实验将大鼠以10gL-1戊巴比妥钠（40mgkg-1）麻醉成功后，作颈部正中切口，解剖出双侧颈总动脉.用两个血管夹（上、下相距约1mL）阻断一侧颈总动脉后切断之，修剪外膜，以11-0尼龙线作原位端端吻合，每个吻合口缝10针.于吻合口注入AdC

6、MVt-PA（治疗组）或AdCMV（对照组），10min后松血管夹.同法处理另一侧颈总动脉.1.4目的基因转录水平的测定术后12h，治疗组和对照组各取2只大鼠，切取以吻合口为中心1cm长的血管.治疗组、对照组血管组织各放一起，采用一步法提取组织总RNA，再行RT-PCR.PCR引物:P1:5’-CGAAGCTTATGGATGCAATGAAGAGAGGG3’HindⅢP2:5’-CGGGTACCTCACGGTCGCATGTTGTCACGAAT3’BamHⅠ由上海Sangon生物工程有限公司合成.1.5目的基因表达产物的活性测定分别于术后第2，3，5，7及14日随机取治

7、疗组、对照组大鼠各2只，取出双侧吻合口，剥离结缔组织，纵行剖开.以同组术后同天数的吻合口组织为一份标本.每份标本行组织培养24h，收集上清，用发色底物法检测t-PA活性.2结果2.1确定阳性克隆用磷酸钙沉淀法将pAd-CMVt-PA及pJM17DNA共转移至293细胞中同源重组，将腺病毒颗粒粗提液再感染293细胞，24h后收集细胞作PCR，从而确定阳性表达克隆（Fig1）.图1略2.2腺病毒的制备在293细胞进行同源重组得到具有感染能力且含有目的基因的腺病毒颗粒，经扩增、纯化，用噬斑法测定病毒滴度为5×109pfumL-1.2.3动物模型情况两组大鼠全部存活，切