兔实验性肺栓塞后组织型纤溶酶原激活物抑制因子

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1、兔实验性肺栓塞后组织型纤溶酶原激活物抑制因子江爱桂，倪松石，卢慧宇，黄剑飞，姜声扬【摘要】目的：研究兔实验性肺血栓栓塞（PTE）后组织型纤溶酶原激活物抑制因子－1(PAI-1)在肺动脉中表达的动态变化。方法：日本健康大耳白兔48只随机平均分为栓塞组和对照组，栓塞组利用自体血栓经股静脉输入建立PTE模型，对照组输入生理盐水。用免疫组织化学及ethods:Rabbitacutepulmonarythromboembolismmodelsbyinjectingauto-bloodclotsintofemoralveininogenactivatorinhibitor-1(PAI-1)inpulmo

2、naryartery.Controlgroupreceivedinjectionofthesamevolumesaline.Specimensbothnormalandmorbidpulmonaryartery0、4、8and24hoursafterPTE,andtheexpressionofplasminogenactivatorinhibitor-1(PAI-1)easuredbyimmunohistochemistryandarker（SantaCruzBiotechnology,USA，产品编号：sc-2035）。小鼠抗大鼠(-actin单克隆抗体为Sigma公司产品，IgG/HRP

3、羊抗大鼠购自北京中山生物工程公司。1．2兔急性肺栓塞模型的建立家兔予3%异戊巴比妥钠30mg/kg麻醉后耳缘静脉采血1ml。凝固45min后做成3～5mm长的的栓子置于10ml生理盐水，于股静脉留置针输入，并于5ml生理盐水冲洗静脉留置针；对照组输入15ml生理盐水[2]。标本采集：分别于栓塞后即刻，4、8、24h处死各栓塞组模型，观察大体标本有无梗死，结扎肺动脉根部,沿肺动脉走行解剖分离双测肺动脉，取出肺动脉,生理盐水冲洗,一侧肺动脉10％的中性甲醛固定24h，取栓塞明显的肺动脉石蜡包埋备用。一侧低温带回实验室，保存与－80℃冰箱中备用。同时留少许肺组织行HE染色病理学观察。1．3免疫组化

4、检测PAI-1(SABC法)石蜡包埋的组织标本4μm连续切片，常规脱腊至水，3％双氧水阻断内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次，微波抗原修复后PBS洗涤。滴加5％BSA封闭液，室温20min后与PAI-1兔抗鼠多克隆抗体（购于武汉博士德生物工程有限公司，产品编号：BA1334）孵育4℃过夜，再以PBS洗涤3次，滴加生物素化羊抗兔IgG（购于武汉博士德生物工程有限公司，产品编号：SA1022）室温30min后滴加试剂SABC，室温静置30min，DBA显色，苏木素复染后封片。1．4in取上清，并与等体积的2×上样缓冲液混匀，100℃加热3～5min。采用Bradford法测定蛋白浓度。以80μg/泳

5、道加样，10％SDS-PAGE凝胶电泳分离，通过电转移法将蛋白转移至PVDF膜。将膜依次经10％脱脂奶粉室温孵育45min，PAI-1多克隆抗体（1∶2000稀释）4℃孵育过夜和IgG/HRP第二抗体室温孵育2h，每次孵育后用TTBS溶液洗膜3次，然后用ECL化学发光剂进行检测。1．5统计学方法采用Stata7.0统计软件进行分析,变量以x±s表示,组间比较采用t检验,组内比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。(责任编辑：)2结果2.1兔实验性肺栓塞后病理改变大体标本观察：实验动物肺表面有点片状出血灶，病变呈双侧分布，上段肺轻于下段肺。结扎肺动脉根部，沿肺动脉行走方向向远段

6、解剖，肉眼可见栓塞部位的肺动脉血管充盈饱满，可探及血管内栓子。栓子栓塞的部位不定，但主要在亚段以上肺动脉。光镜观察各栓塞组肺动脉内可见注入的自体血栓，4h栓塞组肺血管内皮细胞脱落明显,8h肺泡周围及血管内大量炎性细胞浸润，24h栓塞组栓塞周围有混合血栓形成[3]。2.2免疫组织化学光镜下见PAI-1的阳性细胞为胞浆棕染,主要在肺血管内皮细胞中；PAI-1在栓塞后即刻及24h可见明显的细胞内胞浆棕染的阳性细胞，栓塞后4h和8h阳性细胞有所减少，正常对照组各时间点表达明显（见图1）。2.3anagementofacutepulmonaryembolism[J].EurHeartJ,2000,21

7、（16）:1301-1336.[2]倪松石，贲素琴，施裕新，等.实验性肺血栓栓塞症血浆D-二聚体的动态研究[J].中华结核和呼吸杂志，2003，26(12):803－804.[3]江爱桂，卢慧宇，倪松石，等.组织型纤溶酶原激活物在兔实验性肺血栓栓塞肺动脉中表达的动态变化及临床意义[J].实用临床医药杂志，2007,11(9):31-34,39.[4]NichollsSC,HofferEK,Chandlerbo