组织型纤溶酶原激活物基因疗法防治血管吻合口血栓栓塞

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1、组织型纤溶酶原激活物基因疗法防治血管吻合口血栓栓塞　　摘要:目的探讨防止血管吻合口血栓栓塞的新方法，了解组织型纤溶酶原激活物基因疗法防止吻合口血栓栓塞的效果.方法①将含有t-PA基因的重组质粒pAdCMVt-PA与缺陷型腺病毒大框架pJM17共转染病毒包装细胞293细胞，获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒AdCMVt-PA.②实验动物随机分为对照组和治疗组，均用11-0尼龙缝线行大鼠颈总动脉原位端端吻合.治疗组吻合口注射AdCMVt-PA溶液，对照组注射AdCMV（不含t-PA的空载体）.提取吻合

2、口组织的总RNA行RT-PCR，应用发色底物法检测吻合口组织的纤溶酶活力.结果治疗组RT-PCR在2.0kb前面有一条带，对照组则没有.治疗组术后第2，3，5，7和14日均可检测到纤溶酶活力，但第3日活力最高，对照组未检测到纤溶酶活力.结论克隆入腺病毒载体的t-PA基因可在吻合口组织中表达出有生物学活性的t-PA，可能有效地抑制吻合口血栓形成，提高吻合口通畅率.　　Keyosis;thrombo-embolismAbstract:AIMTodevelopaneoticsitesfromthrombo

3、-embolismandtostudytheeffectofgenetherapyinogenactivator（t-PA）geneontheformationofthrombo-embolismofvas-cularanastomoticsites.METHODS1:Rebinantplas-midpAdCMVt-PAlydividedintocontrolandtreatmentgroups.11-0nylonemedicalsutureratcarotidarteryendtoendanast

4、omoses.Inthetreatmentgroup，AdCMVt-PAsolutionoticsiteedentgroup，butbandcouldnotbefoundinthecontrolgroup.Thet-PAac-tivitycouldbedetectedpostoperationonthe2nd，3rd，5th，7thand14thdayinthetreatment，butcouldnotbedetectedinthecontrolgroup.CONCLUSIONt-PAgenecan

5、producet-PAhavingbiologicalactivityatanastomoticsites，possiblypreventingtheformationofthrombo-embolismeffectivelyanddevelopingtheanastomoticpatency.　　0引言　　近年来，随着血管吻合技术的提高及显微外科器械的完善，微小血管吻合的通畅率不断提高，但不能达到百分之百，吻合口局部血栓形成仍是通畅率低的主要原因［1］.临床常用抗凝药物来防治，但效果不理想［2］，

6、所以有必要寻找一种局部抗凝法来提高通畅率.我们采用吻合口注射含抗凝血基因的真核表达载体AdCMVt-PA溶液，以探讨局部基因疗法对吻合口血栓栓塞的预防作用.　　1材料和方法　　1.1试剂、质粒及实验对象RT-PCR试剂盒购自华美公司;t-PA发色底物法检测试剂盒购自上海广慈医学高科技公司;质粒pAdCMVt-PA本实验室构建;pJM17质粒和293细胞为本实验室保存;EM+100ml・L-1小牛血清、青霉素100mg・L-1和链霉素100mg・L-1，37℃

7、，50ml・L-1CO2中培养.　　　1.2重组腺病毒的繁殖、纯化和滴度测定［3，4］提取质粒pAdCMVt-PA及pJM17DNA，将两者用磷酸钙沉淀法共转移至含有腺病毒E1区的293细胞中进行同源重组，得到腺病毒颗粒的粗提液.用此粗提液再感染293细胞，24h后收集细胞作PCR，确定阳性表达克隆.再在293细胞中扩增腺病毒，用氯化铯密度梯度离心法制备纯化的重组腺病毒，并进行透析处理.用噬斑分析法测定腺病毒滴度.分装小管，-80℃保存备用.　　1.3重组腺病毒在吻合口局部治疗实验将大

8、鼠以10g・L-1戊巴比妥钠（40mg・kg-1）麻醉成功后，作颈部正中切口，解剖出双侧颈总动脉.用两个血管夹（上、下相距约1mL）阻断一侧颈总动脉后切断之，修剪外膜，以11-0尼龙线作原位端端吻合，每个吻合口缝10针.于吻合口注入AdCMVt-PA（治疗组）或AdCMV（对照组），10min后松血管夹.同法处理另一侧颈总动脉.　　1.4目的基因转录水平的测定术后12h，治疗组和对照组各取2只大鼠，切取以吻合口为中心1cm长的血管.治疗组、