激光扫描共聚焦显微镜操作流程详解

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1、激光扫描共聚焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope)激光扫描共聚焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope)，英文简写LSCM，俗称confocal。LSCM是一种高科技显微镜，属于最先进的细胞生物学分析仪器。我们学院使用的是瑞士徕卡公司(Leica)的TCSSP5型号的LSCM。使用流程1、登陆ftp://10.31.60.139或5号楼606室公用电脑下载《激光共聚焦预约使用审核表》，打印并填写。2、联系卢剑清（手机：13522745991）审核并

2、签名。3、持已签名的《激光共聚焦预约使用审核表》至5号楼610室预约使用时间，及领取钥匙，联系人：窦凯飞（手机：15210505368）。4、在熟练使用者的指导下，进行实验。5、实验结束，及时归还钥匙。仪器构造和原理LSCM的基本结构主要包括荧光显微镜系统及样品台、激光发射器、扫描器、检测器、图像存储处理和输出设备、计算机控制系统。激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源,普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源,标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。而LSCM以激光为光源,激光具有单色性强﹑方向

3、性好﹑高亮度﹑相干性好等优点,可以避免普通显微镜的缺点。一般常用的气体激光器如氩(Ar)﹑氪(Kr)﹑氦(He)﹑氖(Ne)。illuminatingpinhole（照明针孔）：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与detectorpinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后,通过物镜在样品聚焦。对标本内焦平面上的每一点进行扫描,Focalplane（焦平

4、面）：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。该光斑经过物镜和分光镜等一系列装置的处理，分别在照明针孔及探测针孔两处聚焦。共聚焦的含义由此而来。标本上的被照射点所发射的荧光沿同一光路进入物镜,穿过分光镜后在探测针孔处成像,该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。然后经探测针孔后的光电倍增管(PMT)或冷电感耦合器件(cCCD)逐点或逐线接收,将光信号转变为电信号，传输至计算机，迅速在屏幕上形成荧光图像。LSCM是在荧光显微镜的基础上用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫

5、描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共聚焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。仪器用途1、原位鉴定细胞或组织内生物大分子,观察细胞及亚细胞形态结构：①在细胞原位检测核酸②原位检测蛋白质,抗体及其他分子③检测细胞凋亡④细胞器观察及测定⑤检测细胞

6、融合⑥观察细胞骨架⑧检测细胞内脂肪2、活体细胞或组织功能的实时动态监测：①实时定量测定细胞内Ca2+的变化②测定细胞内PH变化③检测膜电位的变化④检测细胞内活性氧物种的产生⑤检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位⑥检测荧光共振能量转移(FRET)⑦检测荧光漂白恢复(FRAP)样品制备1．组织切片标本实验标本要求单层，并能很好地贴附在样品池中。所以，组织标本无论是石蜡切片还是冰冻切片，均为越薄越好。2．细胞标本细胞种类和纯度，细胞密度和形态。3．承载细胞的器皿Petri皿和玻片。操作步骤一、开机1.依次打开电脑桌右

7、侧“PCMicroscope”、“ScannerPower”及“LaserPower”三个圆形按钮，然后将“LaserPower”按钮右侧的激光开关钥匙（LaserEmission）顺时针旋转90度至“On-1”位置。记录开机时间。2.打开显微镜电源，及荧光电源。3.双击电脑显示屏桌面上的“LASAF”图标启动徕卡共聚焦软件。4.如需使用快扫系统，在“ActivateResonantScanner”选项前打勾。5.点击“OK”以打开软件。打开后显示LASAF基本界面。二、在显微镜下观察样品1.选择合适的物镜，可通过

8、显微镜主机右侧的物镜转换按钮，或软件中的“Objectives”键进行选择。2.将样品置于载物台上，在明场条件下选择合适的视野。通过显微镜主机右侧的按钮进行调焦，以及显微镜主机左侧的“INT”功能键调节光强。3.按“TL/IL”功能键转换至荧光观察方法，通过显微镜前面板的按钮选择合适的荧光滤块，进行样品的荧光观察。4.观察完毕后，按显微镜前面板上的荧光“SH