激光扫描共聚焦显微镜技术

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1、激光扫描共聚焦显微镜技术ThetechniquesofConfocalLaserScanningMicroscopy基础医学研究所王珺激光扫描共聚焦显微镜技术基本组成及原理功能荧光探针的选择样品要求在生物医学中的应用LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制装置Computer计算机Confocalscananddetectorunit共聚焦扫描及检测装置Microscope荧光显微镜Anti-vibrationtable防震台LaserScaningConfocalSystem激光扫描共聚焦显微镜基本

2、配置LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制装置Computer计算机Confocalscananddetectorunit共聚焦扫描及检测装置Microscope荧光显微镜Anti-vibrationtable防震台激光器半导体激光器：405nm氩离子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm氦氖绿激光器：543nm氦氖红激光器：633nm激光扫描共聚焦显微镜基本原理检测针孔和照明针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔高分辨率的光学切片激光穿透性强，可对样本进

3、行一定深度光学断层，获得高标准的连续光学切片实现三维重建LSCM的基本特点观察方式：以荧光为主光源：激光（紫外、可见光）照明方式：点照明、逐点扫描成像方式：共聚焦、逐点成像输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析多重染色样品的观察基本功能多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集光学显微镜分辨率：0.25mm共焦显微镜分辨率：0.18mm基本功能无损伤、连续光学切片，显微“CT”三维重组confocalconventional基本功能定位、定量分析NucleusHochest33258LysosomeFITCMito

4、chondrionTRITC基本功能时间序列扫描:xyt、xyzt和xt扫描感兴趣区域扫描基本功能图像处理功能如对样品中很弱或很强的荧光信号进行增强或减弱、去噪、平滑、提取等操作，从而保证了图像高反差、高清晰度、定位准确。荧光探针的选择选择荧光探针的主要步骤：1、根据实验目的确定需要检测的目标；2、确定可供选择的荧光探针的范围；3、考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备要求；4、荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况几种常用的荧光探针DNA和RNA检测吖啶橙（AO）、碘化丙啶（PI），既可标记DNA又可标记RNA。PI不能进入完

5、整的细胞膜，常用于检测膜损伤、细胞凋亡、细胞核定位、核酸定量等。激发波长536nm发射波长617nm几种常用的荧光探针AO激发波长为492nm，发射波为分别为530/640nm。用激光共聚焦显微镜双通道观察可见：活细胞的胞核呈黄绿色荧光，胞质呈绿色荧光；死细胞呈红色荧光AO492/526DNA强结合方式绿色荧光492/650RNA弱结合方式红色荧光几种常用的荧光探针Hoechst33342Hoechst33258和DAPI，这三种都是DNA的特异性的荧光染料，细胞毒性小，特异性强。与DNA结合后都是以紫外光激发，发射明亮的蓝色荧光，

6、分辨率高。几种常用的荧光探针Hochest33342352/461DNAA-T活细胞Hochest33258352/461DNAA-T活细胞DAPI358/461DNAA-T半通透细胞几种常用的荧光探针蛋白质、酶、抗体及其他分子等的检测FITC（异硫氰酸荧光素）能够结合细胞内总蛋白质，它是检测蛋白质最常用的荧光探针，它还能广泛地结合各种特异性的配体。用488nm的激光器激发后，发出明亮的绿色荧光。光照下易淬灭，不易保存。几种常用的荧光探针另一种常用的共价标记物是罗丹明，其光稳定性比FITC好。其衍生物TRITC（四甲基异硫氰基罗丹明

7、）是常用的共价标记探针，发红色荧光。几种常用的荧光探针绿色荧光蛋白（GFP）已成为跟踪活组织或细胞内基因表达及蛋白质定位的标记物。该蛋白吸收光的波长最高峰在395nm处，在479nm处也有吸收峰；发射的绿色荧光波长最高峰在509nm处，在540nm处伴随有一小峰。因此内源性荧光基团受到紫外光或蓝光激发时，均可发出绿色荧光。几种常用的荧光探针类似于绿色荧光蛋白，目前所使用的荧光蛋白还包括蓝色荧光蛋白（BFP），青色荧光蛋白（CFP）及黄色荧光蛋白(YFP)。几种常用的荧光探针细胞内游离钙离子最常用的有Fluo-3、Fluo-4，能用可

8、见激光（488nm）激发，发射峰为525nm，其乙酰甲酯（AM）形式是Fluo-4AM，无荧光，为不带电荷的亲脂化合物，易于渗透脂膜进入活细胞，在胞内被非特异酯酶水解，释放出游离酸形式的荧光探针分子，此游离态也无荧光，不易漏出胞外，一