激光扫描共聚焦显微镜.ppt

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1、激光扫描共聚焦显微镜在微生物研究中的应用刘盛荣2011-09-09CTC染色BaclightLive/Dead染色BaclightLive/Dead染色激光扫描共聚焦显微成像主要内容1、分子荧光的形成2、微生物研究中常用的荧光染料3、共聚焦显微镜基本原理4、共聚焦显微镜在微生物研究中的应用一、分子荧光的产生1.1分子荧光产生的条件1.基态分子受到能量激发，吸收一定能量后，跃迁至激发态,通常为π→π*、n→π*跃迁2.激发态分子在很短时间内，以电磁辐射的形式释放能量并返回基态，便产生了分子发光（荧光或磷光）1.2

2、影响荧光的因素1.溶剂的影响除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加3.溶液pH对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制二、微生物研究中常用的荧光探针荧光探针主要基于测定微生物的某一生理进行分类1、膜通透性（membraneintegrity）2、代谢活性(metabolicactivity)3、膜电位(membranepotential)4、酯酶活性(esteraseactivity)5、pH梯度(pH

3、gradient)6、其它微生物研究中主要的荧光探针：1、膜通透性(membraneintegrity)BacLightLive/Dead(PI/SYTO9)PIPIPIPIPIPISYTO9SYTO9SYTO9PIPIPIPIPIViablecellDamagedcellSYTO9SYTO9链霉菌不同发酵时期：菌丝活性及内部结构Example1.StainingofStreptomycessp.withBacLightlive/deadL70072、代谢活性(metabolicactivity)微生物代谢活性

4、分析的荧光探针主要有：5-Cyano-2.3-ditolyltetrazoliumchloride(CTC)3-(4,5-Dimethyl-2-thiazyl)-2,5-diphenyl-2-tetrazoliumbromide(MTT)2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumbromide(INT)红色荧光分子无色非荧光分子ViablecellCTC的微生物细胞还原CTCCTFCTFExample2:StainingofStreptomyce

5、ssp.withCTCCTC染色CTC染色3、酯酶活性(esteraseactivity)工作原理：在活性微生物细胞酯酶作用下，将非荧光分子水解，释放出荧光分子并依靠膜的完整性保留于胞内1.Fluoresceindiacetate(FDA)2.5(6)-carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidylester(CFDA-SE)荧光染料作为底物由酯酶所水解产产生荧光分子活性微生物细胞CFDA-SECFDA-SE活性微生物细胞将其还原为荧光分子并沉淀于微生物细胞内4、膜电位（memb

6、ranepotential）工作原理：活性微生物细胞可维持细胞的膜电位，可作为微生物细胞活性的一个评价的生理指标1.带正电荷荧光探针Rhodamine123(Rh123);DiOC6(3)进入活性细胞2.带负电荷荧光探针Bis-(1,3-dibutylbarbituricacid)-trimethineoxonolDiBAC4(3)进入死细胞5、pH荧光探针工作原理：活性细胞可以维持胞内外一个合适的pH梯度，因此，测定微生物细胞内的pH可作为细胞生理状态的一个评价标准1.5(6)-carboxyfluoresc

7、eindiacetatesuccinimidylester(CFDA-SE)2.Pranine3.BCECFProbePhysiologicalfunctionExcitation(nm)Emission(nm)PIMembraneintegrity535617CTCMetabolicactivity450580-660DiBAC4(3)Membranepotential493516Rh123Membranepotential507529FDACFDA-SEEsteraseactivity492517SYTO9

8、Membranepermeant488509一些常见荧光染料的激发与发射波长三、激光扫描共聚焦显微镜3.1激光扫描共聚焦显微镜的组成显微镜光学系统扫描装置激光光源检测系统整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。3.2共聚焦成像原理MoreColorPossibilities2.LessCrossTalk（串色）3.3激光扫描共聚焦显微镜与荧光