共聚焦激光扫描荧光显微镜

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1、共聚焦激光扫描荧光显微镜—基本原理、应用及样本制备原则宋健武汉大学医学院结构生物学研究中心CentreforStructuralBiologyWuhanUniversitySchoolofMedicine什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？共聚焦激光扫描荧光显微镜（ConfocalLaserScanningFluorescenceMicroscope；LSFM）以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统共聚焦系统细胞CT荧光和荧光显微镜一、荧光的基础术语荧光物质：某些物质

2、在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线—荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素激发光(EXCITATION)：能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长)488nm520nm异硫氰酸荧光素(FITC)发射光(EMISSION):发射光谱；发射波峰(最大发射波长)荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料（PI,Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）自发荧光(AUTOFLUORESCENCE):组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。

3、伊文斯蓝、硼化氢钠处理漂白(BLEACH)：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失—漂白。二、荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490长、短通滤色镜组合（LP+KP）：LP450+KP490双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490紫外蓝绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光488nm520nmFITC450nm490nm共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置La

4、serandelectronicControlUnit激光光源及控制装置Computer计算机Confocalscananddetectorunit共聚焦扫描及检测装置Microscope荧光显微镜Anti-vibrationtable防震台LeicaTCSSP-2MPAOBSConfocalSystem共聚焦装置光源针孔检测针孔荧光显微镜光电倍增管步进聚焦电机物镜Bio-RadLaserSharp系统操作，图像处理3-D重建X/Y扫描装置光电倍增管检测针孔光源针孔光源分色镜物镜样本聚集平面共聚焦扫描显微镜光学原理检测针孔和光源针孔始终聚焦于

5、同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔高分辨率的光学切片激光穿透性强，可对样本进行一定深度光学断层，获得高标准的连续光学切片实现三维重建三维胶原基质培养的血管平滑肌细胞共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域只要目的结构是用荧光探针标记的，都可用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联系、肿瘤细胞分类……分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量，DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、定位，荧光能量共振转移大分子构象的改变、受体与配体相互作用……活细胞动态荧光测量：细胞内Ca++、K+、H+等离子的动

6、态分布及动态定量、荧光漂白恢复细胞连接间的信息沟通……直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白IntensityBeforebleachAfterbleach90minafterbleach1.荧光漂白恢复(FluorescenceRecoverafterphotobleaching;FRAP)检测细胞连接间的信息传递2.荧光能量共振转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)I.荧光能量共振转移:受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移

7、。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。供体荧光素受体荧光素1.供体与受体间的距离<10nm或=1-7nm2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠II.荧光能量共振转移的条件488nm520nm650nm540nm650nm488nm520nm供体荧光素(Cy2)受体荧光素(Cy3)供体荧光素(Cy2)受体荧光素(Cy3)FITC/TRITC,Cy3/Cy5,BFP/GFPFluorescenceIntensityTime检测以供体的激发波长的光照射样品,没有共振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振转移时，供体的荧光减弱

8、，受体被激发出现荧光。应用受体与配体的相互作用：亚基的结合与分离大分子构象的改变LigandCy3Cy5III.常用荧光共振转移探针对3.绿色荧光蛋白（GFP）