共聚焦激光扫描显微术

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1、共聚焦激光扫描显微术及其在生物医学中的应用姚忠祥yaozhx@yahoo.com一、概述共聚焦激光扫描显微术(ConfocalLaserScanningMicroscopy,CLSM)特点：1.显微镜成像2.激光扫描3.计算机图象处理简史:马文.闵斯基(MarvinMinsky)1957（美国专利）矛盾：成像质量、扫描速度狭缝扫描:成像质量不佳台阶扫描:光栏不动，移动工作台标本光束扫描：现通用二、基本原理1.光学成像激光器产生的激光经物镜聚焦到样品上反射光或荧光经目镜汇聚于探测器探检测器前有一

2、小孔(Pinhole)汇聚光束2.成像保存以电信号形式储存，可以进行图象分析（参数、伪彩、值等）。3.共轭(confocal)是指光源孔和检测针孔对物镜焦平面是共轭的。宽场照明显微镜和共聚焦图象比较三、CLSM的应用展现最清晰图象细节图象处理功能1.光学切片功能：显微CT微动进步马达最小步距0.1um2.三维图象重建：3D软件X，Y，Z轴重建，立体旋转3.荧光物质的定位，定量与动态测量（单标、双标、多重标记）高速采集Dronpa蛋白FRAP光漂白Folu-EGFP-EB3TubulinActin

3、线粒体4.细胞内PH及Ca,Na等离子定位、双标记组合、OD值与免疫细胞组化、原位杂交技术相结合细胞生物学功能1.粘附细胞的分选：物理化学特性，细胞亚群2.激光细胞显微外科及光陷阱(opticaltrap)技术：激光刀：细胞穿孔、灼烧细胞器、切割染色体、切除神经细胞突起光陷阱：利用激光的增强效应，钳制或移动细胞器、染色体，进行细胞融合、改建、神经丝去除3.荧光漂白恢复技术(FluorescentRedistributionAfterPhotobleaching,FRAP)高浓度脉冲使细胞某一区域

4、荧光淬灭，记录周围非淬灭荧光分子扩散至淬灭区的时间，了解细胞连接的多少、细胞骨架的组装等荧光标记物：CFDAam细胞间通讯连接的影响因素：PH,Ca2+,cAMP等FRAP荧光粹灭漂白恢复法举例荧光染料：二乙基羧化荧光素(carboxyfluoresceindiacetate，CFDA)标本：大鼠膀胱逼尿肌细胞（细胞培养）分组：实验组，可见荧光恢复现象干预组（加GJ阻断剂），无荧光恢复现象观察时间：光漂白后0，2，4分钟ABCDABCD4、膜流动性的测定细胞膜荧光探针受到极化光的刺激激化后，发射

5、光的极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围膜流动性，故极性测量可以反映膜的流动性5.光活化技术或称光笼锁（caged）化合物技术笼锁化合物又称光致不稳定笼锁化合物(Photolabilecagedcompounds)，通过基团修饰以掩蔽生物活性分子，使其以惰性前体形式存在。通常是可逆的。原理：紫外线照射→共价键断裂→释放生物活性分子笼锁化合物的两种光化学反应原理：偶氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光致分解作用1.偶氮苯衍生物：偶氮苯衍生物具有顺式和反式立体同分异构体

6、，其药理性质不同，并可用不同波长光照以控制两种同分异构体间的转化。早在经典的笼锁化合物问世以前，已有乙酰胆碱激动剂与偶氮苯结合生成光敏物质Bis-Q。Bis-Q顺式无活性，用420-440nm光照后即转化成反式而激活，再经过340nm光照后又变成顺式。Bio-Q与电生理技术结合用于研究电鳗和电鳐的乙酰胆碱受体。2.邻硝基甲苯衍生物：目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯的光敏性质合成。当生物活性分子与硝基甲苯结合即暂时失活，故又将后者称为掩蔽基团或笼锁基团。一旦受到光照，连接于侧链碳原子的前体

7、即解离而释放出活性分子、质子和亚硝基副产物。笼锁神经递质、调质及抗体例：光照解笼锁NPE-氨甲酰胆碱→血管平滑肌收缩（氨甲酰释放）Caged入Cell途径：诱入法，酯化法，电极导入法，膜片钳全细胞方式导入法CLSM的优点1.激光是单色光、LM观察、荧光观察2.推进器步距达0.1um（“显微CT”）3.图象以电信号形式记录、储存，可修饰伪彩、测定细胞参数，直接获得图象4.图形经精细调焦的光束成像，清晰度高5.可活体观察、动态观察四、CLSM使用步骤（一）样品准备培养细胞，如用钙Fluo-3可用市售

8、培养皿紫外激发，Fluo-2,0.2um盖玻片制成培养瓶底活组织切片：甘油封片，无自发荧光（二）选择荧光探针1000余种钙：Fluo-3/am(水溶性)不用紫外光激发，可渗透细胞。Fluo-2用紫外激发，不穿透，需用Microinjection观察细胞内PH：Snarf荧光素中插入萘而合成，可与Fluo-3或Fluo-2联合测定细胞内钙与PHCLSM常用荧光探针细胞内钙：Fluo-3,Rhod-1,Indo-1,Fura-2DNA&RNA:碘化丙锭PI,吖啶橙AO膜电位：DiBAC4PH值：SN