共聚焦激光扫描荧光显微镜简介以及原理.ppt

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1、共聚焦激光扫描荧光显微镜什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？共聚焦激光扫描荧光显微镜（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM）以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统共聚焦系统细胞CT荧光和荧光显微镜一、荧光的基础术语荧光物质：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光长的光线—荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素激发光(EXCITATION)：能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线称为该荧光素的激发光

2、。激发/吸收光谱；吸收波峰(最大吸收波长)488nm520nm异硫氰酸荧光素(FITC)发射光(EMISSION):发射光谱；发射波峰(最大发射波长)荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料（PI,Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）自发荧光(AUTOFLUORESCENCE):组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。漂白(BLEACH)：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失—漂白。二、荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。

3、如：BP450-490长、短通滤色镜组合（LP+KP）：LP450+KP490双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490紫外蓝绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光488nm520nmFITC450nm490nm荧光显微镜的不足:1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重荧光的同时采集及共定位。2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧

4、光强度不够。6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠7.只能在二维环境下观察。8.样品不能太厚。9.荧光的串绕无法回避。10.放大倍率小。共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制装置Computer计算机Confocalscananddetectorunit共聚焦扫描及检测装置Microscope荧光显微镜Anti-vibrationtable防震台LeicaTCSSP-2MPAOBSConfocalSystem1.典型产品Nikon的EclipseC1PlusNi

5、kon的EclipseC1Plus1.性能卓越的平场复消色差TIRF物镜（60x，100x），NA=1.49.。这是当前数值孔径最高的油浸物镜2.四孔位针孔转盘：用电脑控制针孔的大小，可在分辨率和光切厚度之间取得最佳平衡。3.时间间隔可变的TimeLapse:可以在拍摄过程中不同的时间段采用不同的时间间隔。2.基本组成一、基本组成（一）激光器:多线氩离子(458nm,488nm,514nm)、氦氖绿(543nm)、氦氖红(633nm)（二）扫描器(内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单色器及检测器)（三）光学装置：根据样品中荧光信号的强弱、大

6、小及分布，调节激光能量、检测孔光栏、光电倍增管（PMT）的检测范围、物镜和电子放大倍数（zoom），以利于采集各种荧光信号。（四）计算机图像存储与处理及控制系统：实现了图像的优化、三维重建，实现了全自动程序化控制采集（检测）样品荧光图像的时间和空间，并和同时采集样品中多重荧光信号的分解及合成图像，对其进行定量测定。3.优点一.分辨率（0.18μm）二.可重构样品的三维结构三.无损伤、连续光学切片四.光谱扫描（分辨由光源波长，物镜参数和针孔直径等决定，如60X，NA1.4的物镜水平分辨率约为0.2μm，垂直分辨率约为0.5μm。）（细菌细胞

7、1-2μm，原核生物细胞1-10μm）优点4.共聚焦原理利用照明针孔和探测针孔实现点照明和探测，并且被探测点位于焦平面。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点。共聚焦原理共聚焦原理1.点照明（为作图方便已将光线发散角放大）共聚焦原理假设是场照明（非共聚焦），会导致：一.发生衍射，使像模糊；二.散射光干扰（即除了成像点外，其余点处有散射光进入探测针孔）；而点照明则不会有这些问题。共聚焦原理消除衍射影响消除背景杂光共聚焦原理2.焦平面点成像共聚焦原理焦平面上的像是最清晰的，从上面的图可以看出，非焦平面点所成的

8、像的光像被探测针孔挡住，不会进入光探头，所以焦平面点成像使像更清晰。共聚焦原理所以共聚焦成像方式可以很大的提高分辨率和成像质量。5.扫描模式一.X—Y轴扫描二.Z轴扫描X—Y轴扫描（1）单光束