激光扫描共聚焦显微镜技术讲座

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1、激光扫描共聚焦显微镜LaserScanningConfocalMicroscope(LSCM)采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上，使用紫外或可见光激发荧光探针，采用共轭聚焦原理和装置，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套集观察、分析和输出为一体系统。它把光学成像的分辨率提高了30%~40%，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。LSCM的发展1957年提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获得了美

2、国的专利。1967年成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横面。1970年牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型的扫描共聚焦显微镜。1984年Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品。1987年White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文，标志着LSCM已成为进行科学研究的重要工具。随后Zeiss、Leica、Meridian等多家公司相继开发出不同型号的共聚焦显微镜。随着技术的不断发展和完善，产品的性能也不断改进和更新，应用的范围也越来越广泛。Hippocampusneuronsexpressi

3、ngGFPLSCM与普通荧光显微镜的图像质量比较荧光显微镜LSCM显微镜成像清晰度的决定因素:1.分辨率2.球差3.色差1、分辨率：指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。人眼及各类显微镜的分辨率人眼分辨率：0.20mm光学显微镜分辨率：0.25mm共焦显微镜分辨率：0.18mm电子显微镜分辨率：0.20nm2、球差：由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，不能聚焦成一点,使成像模糊不清,形成一弥散光斑(俗称模糊圈)，则此光学系统的成像误差称为球差。3

4、、色差：由白色物点向光学系统发出一束白光，经该光学系列折射后，组成该束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各色光，不能会聚于同一点，即白色物点不能结成白色像点，而结成一彩色像斑的成像误差，称为色差。LSCM的重要组件激光光源自动显微镜扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）数字信号处理器计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。激光器显微镜：物镜载物台计算机系统：图像分析与控制系统激光扫描共聚焦显微镜vs荧光显微镜激光扫描共聚焦显微镜荧光显微镜激光扫描共聚焦显微镜中常见的激光器激光器Ar激光器:458nm,476nm,4

5、88nm,514nmHeNe:543nm,633nm固体激光器(UV):405nm激光器的特点:1)方向性好:激光基本延直线传播2)单色性好:=10-8nm3)高亮度:激光方向性好,其在空间上的能量分布是高度集中的。4)偏振性:激光为平面偏振光,光纤耦合显微镜LeicaDMIRBE倒置荧光显微镜物镜LSCM物镜的重要参数NA数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。是物镜的主要技术参数，是判断物镜性能高低的重要标志。N.A=n*sina/2n：物体与物镜间媒质的折射率a2：物镜孔径角的一半溴萘折射率1.66，香柏油1.515，玻璃1.5

6、2，水的为1.3，空气为1。香柏油与玻璃折射率相似，故光折射少，透光率高，成像清楚。N.A.越大：放大倍数越大，分辨率越高，N.A.越大：视场宽度与工作距离越小MagnificationNumericalApertureWorkingDistance(mm)AchromatCorrection4x0.1030.0010x0.256.1020x0.402.1040x0.650.6560x0.800.30100x(oil)1.250.184x20x10x40x60x100x载物台计算机系统图像分析与控制系统分析软件控制软件+激光共聚焦显微镜

7、原理图1.共聚焦显微镜简化原理图用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(lightsourcepinhole)被二向色镜(Dichroicmirror)反射，通过显微物镜(Objectivelens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focalpoint)处。激光照射所产生的荧光(fluorescencelight)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detectionpinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是

8、光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。共轭图2.探测针孔的作用示意图（解释了出射小孔所起到的作用）只