资源描述：
《辛伐他汀裸鼠体内诱导k562细胞凋亡的分子机制 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、辛伐他汀裸鼠体内诱导K562细胞凋亡的分子机制【摘要】目的：探讨不同剂量的辛伐他汀处理裸鼠体内K562细胞的信号通路的分子变化，以说明辛伐他汀诱导K562细胞凋亡的分子机制.方法：体外培养K562细胞并经皮下接种Balb/cnu/nu裸小鼠K562细胞，构建裸小鼠的K562细胞动物模型.采用缺口末端标记技术TUNEL法检测辛伐他汀诱导K562细胞早期凋亡的变化.采用RTPCR检测K562细胞中Ras分子和PI3KAKT信号通路的nras,pi3k,akt1,nfκb1mRNA的差异表达.结果:不同剂量的辛伐他汀能够诱导裸鼠体内K562细胞凋亡，并随
2、剂量的增加凋亡率逐渐增高（P0.01）；不同剂量的辛伐他汀能够引起nras,pi3k,akt1,nfκb1mRNA的表达差异（P0.01）.结论:辛伐他汀能够引起参与K562细胞凋亡的Ras分子和PI3KAKT信号通路的基因变化，从一定的角度说明辛伐他汀在体内能够诱导K562细胞凋亡.【关键词】辛伐他汀；K562细胞；裸鼠；凋亡 0引言 慢性粒细胞白血病(CML)融合基因bcr/abl编码产物P210bcr/abl可激活Ras,PI3K,STATs等多条信号途径.辛伐他汀对慢性粒细胞白血病细胞的作用机制多限于体外研究，有必要观察和探讨其在实验动物体
3、内的效果和作用机理.而且，p21ras和PI3K的上游激活可启动BcrAbl诱导的转化，其下游靶标仍未完全清楚〔1〕.我们用辛伐他汀作用裸鼠体内K562细胞，检测它对裸鼠体内K562细胞的影响，以说明辛伐他汀是否通过引起裸鼠体内K562细胞中Ras分子和Ras下游的PI3KAKT信号通路的分子水平的变化来诱导K562细胞凋亡的发生. 1材料和方法 1.1材料 12只健康裸鼠，雌性，4+周龄，购自四川大学华西医学中心，并饲养于SPF标准的实验室.辛伐他汀购自中国药品生物制品检定所，以无水乙醇溶解后，再加入与辛伐他汀等摩尔的NaOH，50℃水浴2h，调
4、整pH值至7.20，过滤除菌，调节浓度至0.2g/L备用.噻唑蓝、二甲亚砜购自Sigma公司，培养基和胎牛血清购自Gibco公司，TUNEL试剂盒为美国Roche公司产品.Trizol和逆转录试剂ReverTraAce购自Bioflux公司，扩增的基因引物由英骏生物技术有限公司合成，PCR试剂由北京天为时代科技有限公司提供. 1.2方法 1.2.1细胞培养 K562细胞购自四川大学华西医学中心，以含100mL/L灭活小牛血清，100万U/L青霉素，80万U/L链霉素的RPMI1640培养液于37℃,5mL/LCO2培养箱中培养. 1.2.2慢性粒细胞
5、白血病动物模型的构建 取对数生长期的K562细胞用PBS洗涤2次，调整至5×1010/L，于裸鼠右前腋下皮下注射0.4mL,待接种K562细胞的3只裸鼠身上的肿瘤组织长到2cm3左右时，处死裸鼠.取肿瘤组织均匀地分成体积相当的小块组织进行另外12只裸鼠的皮下移植.待皮下移植的肿瘤组织长到0.5cm3左右时，将12只裸鼠随机分成3组，对照组4只，腹腔注射生理盐水0.2mL，处理组分成2个剂量组，各4只，T1组注射0.2g/L的辛伐他汀0.25mL，T2组注射0.2g/L的辛伐他汀0.4mL.对照组和处理组隔日分别注射生理盐水和辛伐他汀，连续6次. 1.2.
6、3原位末端转移酶标记法（TUNEL） 检测肿瘤组织细胞早期凋亡按原位凋亡基因检测试剂盒说明书的步骤进行操作,检测细胞凋亡.同时设立阴性对照和阳性对照，阴性对照不加Tunel混合液，阳性对照加DNase. 1.2.4RTPCR检测 RTPCR检测nras,pi3k,akt1,nfκb1mRNA的差异表达.取质量相等的肿瘤组织进行冰上匀浆，按照总RNA提取试剂说明书，加入1mLTrizol提取总RNA,紫外分光光仪定量.RNA逆转录合成cDNA,逆转录体系40μL,其中总RNA2μg,42℃水浴50min,然后进行PCR扩增.各基因的正义和反义引物
7、序列分别是nras:F5＇>3＇TACATCGAGACCTCGGCCAA,R3＇>5＇CGTTCACACACGAGAGGACT，产物150bp；pi3k:F5＇>3＇AACTCTGGGGATGACCTGGA，R3＇>5＇AGGCGGTCACAACACTCCTA，产物300bp;akt1F5＇>3＇AGGGTTGGCTGCACAAACGA,R3＇>5＇GTTGTTGAAGAGACACCGCG，产物150bp;nfκb1:F5＇>3＇TGAAGTGATCCAGGCAGCCT，R3＇>5＇CACC
8、TCTGTAGGAAGGCGTT，产物150bp.p
