辛伐他汀裸鼠体内诱导k562细胞凋亡的分子机制论文

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时间:2018-07-11

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1、辛伐他汀裸鼠体内诱导K562细胞凋亡的分子机制论文【摘要】目的:探讨不同剂量的辛伐他汀处理裸鼠体内K562细胞的信号通路的分子变化,以说明辛伐他汀诱导K562细胞凋亡的分子机制.方法:体外培养K562细胞并经皮下接种Balb/cnu/nu裸小鼠K562细胞,构建裸小鼠的K562细胞动物模型.采用缺口末端标记技术TUNEL法检测辛伐他汀诱导K562细胞早期凋亡的变化.采用RTPCR检测K562细胞中Ras分子和PI3KAKT信号通路的nras,pi3k,akt1,nfκb1mRNA的差异表达.结果:不同剂量的辛伐他汀能够诱导

2、裸鼠体内K562细胞凋亡,并随剂量的增加凋亡率逐渐增高(P0.01);不同剂量的辛伐他汀能够引起nras,pi3k,akt1,nfκb1mRNA的表达差异(P0.01).结论:辛伐他汀能够引起参与K562细胞凋亡的Ras分子和PI3KAKT信号通路的基因变化,从一定的角度说明辛伐他汀在体内能够诱导K562细胞凋亡.【关键词】辛伐他汀;K562细胞;裸鼠;凋亡0引言慢性粒细胞白血病(CML)融合基因bcr/abl编码产物P210bcr/abl可激活Ras,PI3K,STATs等多条信号途径.辛伐他汀对慢性粒细胞白血病细胞的作用机

3、制多限于体外研究,有必要观察和探讨其在实验动物体内的效果和作用机理.而且,p21ras和PI3K的上游激活可启动BcrAbl诱导的转化,其下游靶标仍未完全清楚[1].我们用辛伐他汀作用裸鼠体内K562细胞.freela公司,培养基和胎牛血清购自Gibco公司,TUNEL试剂盒为美国Roche公司产品.Trizol和逆转录试剂ReverTraAce购自Bioflux公司,扩增的基因引物由英骏生物技术有限公司合成,PCR试剂由北京天为时代科技有限公司提供.1.2方法1.2.1细胞培养K562细胞购自四川大学华西医学中心,以含100mL

4、/L灭活小牛血清,100万U/L青霉素,80万U/L链霉素的RPMI1640培养液于37℃,5mL/LCO2培养箱中培养.1.2.2慢性粒细胞白血病动物模型的构建取对数生长期的K562细胞用PBS洗涤2次,调整至5×1010/L,于裸鼠右前腋下皮下注射0.4mL,待接种K562细胞的3只裸鼠身上的肿瘤组织长到2cm3左右时,处死裸鼠.取肿瘤组织均匀地分成体积相当的小块组织进行另外12只裸鼠的皮下移植.待皮下移植的肿瘤组织长到0.5cm3左右时,将12只裸鼠随机分成3组,对照组4只,腹腔注射生理盐水0.2mL,处理组分成2个剂量组,各

5、4只,T1组注射0.2g/L的辛伐他汀0.25mL,T2组注射0.2g/L的辛伐他汀0.4mL.对照组和处理组隔日分别注射生理盐水和辛伐他汀,连续6次.1.2.3原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测肿瘤组织细胞早期凋亡按原位凋亡基因检测试剂盒说明书的步骤进行操作,检测细胞凋亡.同时设立阴性对照和阳性对照,阴性对照不加Tunel混合液,阳性对照加DNase.1.2.4RTPCR检测RTPCR检测nras,pi3k,.freelRNA的差异表达.取质量相等的肿瘤组织进行冰上匀浆,按照总RNA提取试剂说明书,加入1mLTrizol

6、提取总RNA,紫外分光光仪定量.RNA逆转录合成cDNA,逆转录体系40μL,其中总RNA2μg,42℃水浴50min,然后进行PCR扩增.各基因的正义和反义引物序列分别是nras:F5′3′TACATCGAGACCTCGGCCAA,R3′5′CGTTCACACACGAGAGGACT,产物150bp;pi3k:F5′3′AACTCTGGGGATGACCTGGA,R3′5′AGGCGGTCACAACACTCCTA,产物300bp;akt1F5′3′AGGGTTGGCTGCACAAACGA,R3′5′GTTGTTGAAGA

7、GACACCGCG,产物150bp;nfκb1:F5′3′TGAAGTGATCCAGGCAGCCT,R3′5′CACCTCTGTAGGAAGGCGTT,产物150bp.pi3k,akt1,nfκb1的内参GAPDH1:5′3′ACCACAGTCCATGCCATCAC,3′5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA;产物450bp;nras的内参GAPDH2:5′3′GGCCTCCAAGGAGTAAGACC,3′5′AGGGGTCTACATGGCAACTG,产物147bp.PCR反应体系为:总体积25μL,cDNA

8、3μL,上下游引物各1μL,2×mastermix12.5μL,用ddH2O补足至25μL.扩增条件为:94℃5min,94℃1min,59℃1min,72℃1min,30个循环;72℃10min,4℃30min.取10μL目的基因扩

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