电化学发光测定原理

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1、电化学发光免疫测定电化学发光免疫测定电化学发光反应：电化学发光（electro－chemiluminescence，ECL)是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光两个过程。化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+(图1）和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面同时各失去一个电子发生氧化反应（图2）。二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂。TPA被氧化成阳离子自由基TPA+*（参见图2），后者很不稳定，自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA*，这是一种非常强的还原剂。这两个高反应基团在电极表面迅速反应，三价的[Ru(bpy

2、)3]3+被还原形成激发态的二价[Ru(bpy)3]2+*，能量来源于[Ru(bpy)3]3+和TPA*之间存在的高电化学电位差。TPA*自身被氧化成二丙胺和丙醛。接着激发态的[Ru(bpy)3]2+*衰减成基态的[Ru(bpy)3]2+，同时发射一个波长620nm的光子。这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号得以增强。图1三联吡啶钌NHSRu2＋*-H+光子TPA*Ru3+Ru2＋TPA+*TPA＋-e-e＋图2在电极表面的ECL反应Ru2＋:[Ru(bpy)3]2+基态Ru3＋:[Ru(bpy)3]3+氧化态Ru2＋*:[Ru(bpy)3]2+*激发态二、电化学发光免疫

3、测定以三联吡啶钌作为标记物，标记抗原或抗体，通过免疫反应及ECL反应，即可进行电化学发光免疫测定（ECLIA）。在实际应用中则尚有特定的仪器和试剂。瑞士罗氏公司（ROCHE）的ElecsysECLIA系统，综合了各种先进技术，具有独特的优越性，已在医学检验中取得广泛应用。Elecsys全自动分析仪分成两个部分：在试管内化学反应部分和在流动池内的ECL反应部分。（一）试管内的化学反应1、试剂的组成在Elecsys试剂的制备中，包括电化学发光剂的标记和抗原或抗体的固相化，应用了多种先进技术，简述如下：（1）电化学发光剂的标记[Ru(bpy)3]2+需经化学修饰形成活化的衍生物后才能与抗体或抗原形

4、成结合物。有多种活性基团可与[Ru(bpy)3]2+分子中的砒啶基反应。在Elecsys试剂中采用的是N羟基琥珀酰胺酯（NHS）（图1）。该衍生物具有水溶性，可与抗体、蛋白质抗原、半抗原、激素、核酸等各种分子结合形成稳定的标记物。而且[Ru(bpy)3]2＋NHS分子量很小，与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性。（2）固相载体Elecsys中采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8mm的聚苯乙烯微粒。其特点是表面积极大，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度快。由于带有磁性，在游离标记物与结合标记物分离时，只需用磁铁吸引，方便迅速。（3）链

5、霉亲和素与生物素系统的应用链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）是具有很强的非共价相互作用的一对化合物。一分子SA可与4分子B相结合。在Elecsys的试剂中，SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上，形成通用的能与B结合的固相载体。另一试剂为与经活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时，B化合的抗原或抗体即结合在磁性微粒上。2、在试管中的反应反应分两个步骤。以双抗体夹心法测抗原为例，试剂含以下组分：a、[Ru(bpy)3]2+标记的抗体b、生物素化合的抗体c、SA磁性微粒d、TPA溶液e、洗涤液（1）步骤一在试管中加试剂a、b及待测标本（

6、含抗原），反应式如下（图3）。反应在液相中进行，37oC下5－10分钟内完成。（2）步骤二：在上述反应液中加入试剂c，反应式如下（图4）。反应在接近液相的条件中进行，37OC下5－10分钟内完成。下一个步骤为结合的标记抗体与游离的标记抗体相分离，此步骤及以下的电化学发光反应，在Elecsys的流动池中进行。（二）流动池中的电化学发光反应1、流动池的基本结构流动池是电化学发光过程中所有电化学发光反应进行的场所（图5）。反应液由蠕动泵运送入流动池，反应后由流动池流出。一个激发电极在流动池的下方，两个测定电极安装在激发电极上方的两侧，留出一个清晰的窗口以便使发射的光子被光电倍增管收集。在流动池下装

7、置可移动的用以吸引磁性微粒的磁铁。2、电化学发光反应的步骤（1）将试管内两步反应结束的反应液输入流动池，由于磁铁吸引，磁性微粒被吸着在电极上，其余反应物流出流动池，完成游离的和结合的标记抗体的分离。（2）将TPA溶液送入流动池,将残余的游离标记抗体排出流动池,在流动池中充满TPA溶液。（3）撤下磁铁，电极上通电，三联吡啶钌与TPA发生电化学发光反应，发出的光被光电倍增管收集，测定光强度。（4）通过换算得出待测