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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究第期2010年月ChineseJournalofAnalyticalChemistry~DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00000酶促电化学发光法测定血清总胆汁酸丁敏*王箭张晓清邓文平(重庆医科大学医学检验系,临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆400016)摘要利用胆汁酸在氧化型辅酶I(NAD+)共存下被3α-类固醇脱氢酶(3α-HSD)催化脱氢,同时NAD+被还原为还原型辅酶I(NADH)可增强三联吡啶钌(Ru(bpy)2+)的电化学发光(ECL)信号,实现电化学发光法3间接检测胆汁酸。检测池中含2.5mmol/LRu(
2、bpy)2+,833U/L3α-HSD,70nmol/LNAD+,50mmol/L磷3酸盐缓冲液(pH8.0)。ECL强度与胆汁酸的浓度在1.0~100fmol/L范围内呈良好的线性关系,线性方程y=0.7707x+12.04(r=0.9975);检出限为0.02fmol/L;平均回收率为97.5%。本方法与临床采用的酶循环放大法有较好的相关性。关键词胆汁酸;电化学发光;酶;血清1引言胆汁酸(Bileacid,BA)是内源性胆固醇在肝脏内的主要代谢产物,目前认为血清总胆汁酸水平是[1]唯一可同时反映肝脏分泌、合成与代谢及肝细胞损伤三方面的血清学指标。检测总胆汁酸的常用方[2][3][4]法高
3、效液相色谱(HPLC)法,高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)法和酶法。色谱法需要衍生和水解,[5]测定过程较为繁琐;而质谱法价格昂贵,都不适合临床检测。临床使用的酶循环放大法测定总胆汁酸成本较高,且灵敏度有待进一步提高。电化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)分析法具有可控性好、灵敏度高、选择性好、仪器简单等优点。ECL法中采用较多的是在水溶液中具有良好电化学可逆性和稳定性的三联吡啶钌反应体系[7]。还原型辅酶I(NADH)是许多酶反应的辅酶且能够与Ru(bpy)2+发生电化学发光,经酶反应可将不3能与Ru(bpy)2+反应产生ECL的物质(如葡萄糖、乙醇和二
4、氧化碳等)与可以发光的NADH相关联,实现3[8,9]其酶促间接ECL检测。本实验采用3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)对胆汁酸(3α-羟类固醇)进行催化脱氢,伴随氧化型辅酶I(NAD+)被还原为NADH,建立了酶促电化学发光检测血清总胆汁酸的方法。本方法不需对标本进行前处理,灵敏度高,快速,且与现临床采用的酶循环放大法有较好的相关性。2实验部分2.1仪器与试剂MPI-B型多参数化学发光分析测试系统(西安瑞迈分析仪器有限公司)。电化学发光检测采用三电极体系:Pt圆盘电极(Φ500μm)为工作电极、Pt丝(1mm)为对电极、Ag/AgC1(饱和KC1)为参比电极。2+胆汁酸标准品(Sigma
5、-Aldrich公司);3α-HSD(酶活力为6.09U/mg,迈克公司);Ru(bpy)3+和NADH(Roche公司);其它试剂均为国产分析纯。实验用水经Milli-Q系统(美国MilliporeNAD公司)纯化。2.2实验方法将电化学发光检测池放入发光检测仪的暗盒中,使透光窗正对光电倍增管入射窗,检测池中含2+,833U/L3α-HSD,70nmol/LNAD+,50mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS,2.5mmol/LRu(bpy)3pH8.0),光电倍增管高压为-700V。每次实验开始时,一般在0.2~1.25V(vs.Ag/AgCl)内进行循环伏安扫描,若可得到重复可逆的循环伏安谱
6、图,则认为电极体系运行正常。恒电位设置为1.17V,待2010-04-20收稿;2010-07-06接受*E-mail:dingmin@cqmu.edu.cn分析化学第38卷发光信号基线稳定后采用注射进样5μL(血清稀释109倍)。检测池内容物每1h更换一次。采用传统的三电极体系:工作电极为直径为500μm的铂圆盘电极,辅助电极为直径为1mm铂电极,参比电极为直径为300μmAg/AgCl电极(内充饱和KCl溶液)。3结果与讨论3.1缓冲溶液对ECL强度的影响介质是影响电化学发光和酶促反应的主要因素。NAD+偶联的3α-HSD的催化过程是NAD+与一个脱氢酶的活性中心结合,从胆汁酸得到氢和电
7、子后被还原成NADH/H+,随后NADH离开酶的活性中心。酶反应介质的pH值可影响酶分子活性中心上必需基团、底物和辅酶的解离程度,从而影响酶与[7,10]底物的结合及酶的催化作用。酶的最适pH值不是酶的特征常数,它与缓冲液的种类和浓度有关。研究发现,以PBS为介质时,ECL信号的信噪比最大,且重现性较好。本实验分别考察了介质PBS的pH值和浓度对ECL强度的影响。PBS的pH值在4~10范围内对ECL强度的影
